Оцветяването по Гимза е техника, използвана в микробиологията и цитогенетиката за оцветяване на клетки и тъкани, позволяваща визуализация на специфични структури. Разработено от Густав Гимза през 1904 г., оцветяването по Гимза е една от най-широко използваните техники в диагностичните лаборатории за идентифициране на микроорганизми, паразити и хромозоми.
Оцветяването по Гимза изисква материали като оцветител по Гимза, метанол и дестилирана вода. Техниката включва фиксиране на клетки върху стъклени слайдове, последвано от нанасяне на оцветител по Гимза, разреден в метанол. След оцветяване клетките се промиват с дестилирана вода и се наблюдават под микроскоп.
Основните приложения на оцветяването по Гимза включват идентифицирането на патогени като Plasmodium (който причинява малария), Trypanosoma (който причинява болестта на Чагас) и бактерии като Chlamydia и Rickettsia. Освен това, оцветяването по Гимза се използва широко в хромозомния анализ за диагностициране на генетични заболявания и идентифициране на хромозомни аномалии.
Ръководство стъпка по стъпка за ефективно извършване на оцветяване по Гимза.
Оцветяването по Гимза е основна техника в клиничния анализ и научноизследователските лаборатории. То позволява визуализиране на различни клетъчни структури, като хромозоми, паразити и бактерии, чрез специфично оцветяване на техните компоненти. В тази статия ще обясним стъпка по стъпка как да се извърши ефективно оцветяване по Гимза.
Етап 1: Пригответе разтвор на Гимза, който може да бъде закупен готов или приготвен от прах. Разтворът трябва да се разреди в дестилирана вода в препоръчаното от производителя съотношение.
Етап 2: Фиксирайте пробата върху предметно стъкло, като използвате топлина или фиксатори, като например етилов алкохол. Уверете се, че пробата е здраво фиксирана, за да избегнете деформация по време на оцветяване.
Етап 3: Покрийте фиксирания образец с разтвор на Гимза, като се уверите, че цялата повърхност е равномерно покрита. Оставете предметното стъкло в контакт с разтвора за определен период от време, обикновено между 10 и 30 минути.
Етап 4: Изплакнете предметното стъкло под течаща вода, за да отстраните излишното оцветяване. Внимателно подсушете предметното стъкло с абсорбираща хартия или сгъстен въздух.
Етап 5: Наблюдавайте оцветената проба под светлинен микроскоп, използвайки подходящи увеличителни обективи. Оцветяването по Гимза ще позволи визуализиране на клетъчните структури с по-голяма яснота и контраст.
Оцветяването по Гимза се използва широко в различни области на биологията и медицината, като например диагностициране на паразитни заболявания, анализ на кръвни клетки и идентифициране на инфекциозни агенти. Чрез правилното следване на описаните по-горе стъпки е възможно да се получат точни и надеждни резултати с оцветяването по Гимза.
Разберете подробно процеса на оцветяване по Гимза и как работи.
Оцветяването по Гимза е метод, широко използван в микробиологичните и хематологичните лаборатории за визуализиране на клетъчни структури и откриване на патогени. Разработен от Густав Гимза през 1902 г., този метод се основава на афинитета на основните и киселинните багрила към различни клетъчни компоненти.
Необходимите материали за оцветяване по Гимза включват оцветител по Гимза, разтвори за фиксация и обезцветяване, препарати за пързалки, покривни стъкла и микроскоп. Оцветителят по Гимза е смес от метиленово синьо, еозин и глицерин и се използва за оцветяване на ядрените и цитоплазмените структури на клетките.
Техниката на оцветяване по Гимза включва фиксиране на клетки върху предметно стъкло, последвано от нанасяне на оцветител по Гимза за определен период от време. След оцветяване клетките се промиват с дестилирана вода и се обезцветяват, за да се отстрани излишното оцветяване. Накрая предметните стъкла се изсушават и се наблюдават под микроскоп.
Основните приложения на оцветяването по Гимза включват идентифициране на кръвнопренасяни паразити, като Plasmodium spp., и диференциация на кръвни клетки в периферни кръвни натривки. Освен това, този метод се използва широко за идентифициране на бактерии, вируси и други патогени в клинични проби.
Действието му се основава на афинитета на основните и киселинните багрила с различни клетъчни компоненти, осигурявайки ясни и детайлни изображения под микроскоп.
Разберете процедурата по патологична анатомия с оцветяване по Гимза за клиничен анализ.
Оцветяването по Гимза е техника, използвана в анатомичната патология за клиничен анализ на тъканни проби. Разработено от немския учен Густав Гимза, това оцветяване е широко използвано поради способността си да откроява различни клетъчни компоненти, като ядра, хромозоми и паразити.
Оцветяването по Гимза изисква редица материали, включително оцветител по Гимза, метилиран спирт, физиологичен разтвор и стъклени слайдове. Процедурата включва фиксиране на пробата в метилиран спирт, нанасяне на оцветител по Гимза и промиване със физиологичен разтвор. След оцветяване пробите се наблюдават под микроскоп за анализ.
Оцветяването по Гимза се използва широко в лабораториите по анатомична патология за идентифициране на различни патологии, като паразитни инфекции, левкемия и автоимунни заболявания. Техниката позволява подробен анализ на клетъчните структури, улеснявайки клиничната диагноза и мониторинга на лечението.
Употребата му е от съществено значение за диагностицирането и лечението на различни заболявания, което го прави незаменима техника за здравните специалисти.
Идентифициране на багрилото, използвано за оцветяване на кръвна натривка.
Оцветяването по Гимза е често срещан метод, използван за наблюдение на различни видове кръвни клетки в кръвна натривка. Основното багрило, използвано в този процес, е Оцветяване по Гимза, което е смес от метиленово синьо, еозин и лазурен B. Това багрило е особено ефективно при оцветяване на структури като клетъчни ядра, хромозоми и цитоплазмени включвания.
Байц Giemsa: основа, материали, техника и употреба
O Оцветяване по Гимза е вид оцветяване за клинични проби, базирано на смес от киселинни и основни багрила. Създаването му е вдъхновено от работата на Романовски, където Густав Гимза, немски химик и бактериолог, го усъвършенства, като добавя глицерол за стабилизиране на съединенията.
Промените, направени в оригиналната техника на Романовски, ни позволиха значително да подобрим микроскопските наблюдения; следователно техниката беше наречена оцветяване по Гимза.
Тъй като е проста, високофункционална и икономична техника, тя понастоящем се използва широко в клиничната лаборатория за хематологични натривки, проби от костен мозък и тъканни срези.
Техниката на оцветяване по Гимза е много полезна за цитологични изследвания, тъй като позволява наблюдение на специфични клетъчни структури. Тази техника оцветява цитоплазмите, ядрата, ядрецата, вакуолите и гранулите на клетките, като е способна да различи фини следи от хроматин.
Освен това могат да бъдат открити значителни промени в размера, формата или цвета на ядрото, където е възможно да се визуализира загубата на връзката ядро-цитоплазма.
От друга страна, той позволява идентифицирането на незрели клетки в костния мозък и периферната кръв, което е важно за диагностицирането на сериозни заболявания като левкемия. Също така позволява откриването на хемопаразити, извънклетъчни и вътреклетъчни бактерии, гъбички и други патогени.
В цитогенетиката се използва широко, тъй като е възможно да се изучава клетъчната митоза.
Фон дьо тен Giemsa
Оцветителите от типа Романовски използват контраст между киселинни и основни багрила, за да оцветят съответно основни и киселинни структури. Както може да се види, киселинните багрила имат афинитет към оцветяване на основни структури и обратно.
Основното използвано багрило е метиленово синьо и неговите окислени производни (Azure A и Azure B), докато киселинното багрило е еозин.
Киселинните структури на клетките са нуклеинови киселини, сегментирани базофилни гранули и други, така че те се оцветяват с метиленово синьо.
В същия смисъл, основните структури на клетките са хемоглобин и някои гранули, като тези, съдържащи се в сегментирани еозинофили, наред с други; Те ще бъдат оцветени с еозин.
От друга страна, тъй като метиленовото синьо и небесносиньото се характеризират като метахроматични багрила, те могат да осигурят променлив тон на различни структури в зависимост от полианионния заряд, който притежават.
Ето как стратегическата комбинация от основни и киселинни багрила може да развие широк спектър от цветове, според биохимичните характеристики на всяка структура, вариращи от нюанси на бледосиньо, тъмносиньо, лилаво и лилаво в случай на киселинни структури.
Въпреки че цветът, осигурен от еозина, е по-стабилен, той генерира цветове между червеникаво-оранжево и сьомгово.
Материали
Материали за приготвяне на основния разтвор
Приготвянето на основния разтвор изисква претегляне на 600 mg прахообразно багрило Giemsa, измерване на 500 ml метилов алкохол без ацетон и 50 ml неутрален глицерин.
Метод за приготвяне на основния разтвор
Поставете претегления прах Гимза в хаванче. Ако има бучки, те трябва да се стрият на прах. След това добавете значително количество от измерения глицерин и разбъркайте добре. Изсипете получената смес в много чиста кехлибарена бутилка.
Останалият глицерин се добавя към хоросана. Разбъркайте отново, за да отстраните останалата боя, която е полепнала по стените на хоросана, и след това го изсипете в същата бутилка.
Бутилката се покрива и се транспортира за 2 часа във водна баня при 55°C. Докато е във водната баня, сместа се разбърква леко на всеки половин час.
След това сместа се оставя да се охлади, преди да се добави алкохолът. Част от измерения алкохол първо се добавя към хоросана, за да се отмие докрай останалото багрило, след което се добавя към сместа заедно с останалия алкохол.
Този препарат трябва да се остави да отлежава поне 2 седмици. Частта, използвана в матерната луга, трябва да се филтрира.
За да се избегне замърсяване на препарата, се препоръчва частта, която ще се използва постоянно, да се прехвърли в малка кехлибарена бутилка с капкомер. Допълвайте всеки път, когато реагентът се изчерпи.
Материали за приготвяне на буферен разтвор
От друга страна, буферен разтвор с pH 7,2 се приготвя, както следва:
6,77 g натриев фосфат (безводен) (претеглен NaHPO 4 ), 2,59 г калиев дихидрогенфосфат (KH 2 PO 4 ) и дестилирана вода до 1000 мл.
Окончателна подготовка на багрилото
За да се приготви крайният разтвор за оцветяване, се измерват 2 ml от филтрирания основен разтвор и се смесват с 6 ml от буферния разтвор. Сместа се разклаща.
Един важен факт, който трябва да се вземе предвид, е, че техниките за приготвяне на багрила могат да се променят в зависимост от търговската инсталация.
Допълнителни материали, необходими за оцветяване
В допълнение към описаните материали, трябва да има цветни мостове, тениски с вода или тампон за пране на дрехи, чаршафи с предмети или калъфи, таймер за контрол на времето за оцветяване и попиване на хартията или някакъв материал, който служи за съхнене (марля или памук).
Техника
Процес на оцветяване
1) Преди оцветяване, пробата трябва да се разнесе върху чисто предметно стъкло.
Пробите могат да бъдат кръв, костен мозък, хистологични тъканни срези или цервикално-вагинални проби. Препоръчително е пастите да са тънки и да се оставят да изсъхнат за 1 до 2 часа преди оцветяване.
2) На оцветяващ мост се поставят всички цветни листа. Винаги се работи в един и същ ред и всяко листо е ясно обозначено.
3) Капнете няколко капки 100% метилов алкохол (метанол) върху намазката и оставете за 3 до 5 минути, за да фиксирате и дехидратирате пробата.
4) Изхвърлете метанола, намиращ се върху листа, и го оставете да изсъхне на въздух.
5) След като изсъхне, добавете крайния разтвор за оцветяване с капкомер, докато покриете цялото листо. Оставете го да действа 15 минути. Някои автори препоръчват до 25 минути. Зависи от магазина.
6) Отцедете петното и измийте намазката с дестилирана вода или буферен разтвор от 7.2.
7) Върху абсорбираща хартия оставете листата да изсъхнат на въздух, подредени вертикално с помощта на опора.
8) Избършете задната страна на предметното стъкло с марля или памучен тампон, потопен в алкохол, за да отстраните евентуалното багрило.
комунални услуги
Техниката на оцветяване по Гимза се използва в няколко области, включително: хематология, микология, бактериология, паразитология, цитология и цитогенетика.
хематология
Това е най-често срещаното приложение на това оцветяване. С него може да се идентифицира всяка клетка, присъстваща в пробите от костен мозък или периферна кръв. В допълнение към оценката на броя на клетките във всяка серия, то може да открие левкоцитоза или левкопения, тромбоцитопения и др.
Тъй като е чувствителен към идентифициране на незрели клетки, е полезен при диагностицирането на остра или хронична левкемия. Може също да диагностицира анемии, като сърповидно-клетъчна анемия, наред с други.
Микология
В тази област е обичайно да се използва Histoplasma capsulatum (вътреклетъчна диморфна гъбичка) в тъканни проби.
Бактериология
В хематологични натривки, оцветени с Giemsa, е възможно да се открият Борелии при пациенти със заболяване, наречено рецидивираща треска. Спирохети се наблюдават в изобилие сред еритроцитите в проби, събрани в пика на треската.
Възможно е също така да се визуализират вътреклетъчните бактерии като Рикетсия e Chlamydia трахоматис в заразените клетки.
Паразитология
В областта на паразитологията, оцветяването по Гимза е позволило диагностицирането на паразитни заболявания като малария, болест на Чагас и лайшманиоза.
При първите два паразита, Plasmodium sp e Трипанозома крузи, съответно, могат да се видят в периферната кръв на инфектирани пациенти и могат да бъдат открити в различни стадии в зависимост от стадия на заболяването.
За да се подобри търсенето на паразити в кръвта, се препоръчва използването на оцветяване по Гимза, смесено с оцветяване по Май-Грюнвалд.
По подобен начин, кожната лайшманиоза може да бъде диагностицирана чрез оценка на оцветени с Гимза кожни биопсии проби, където е открит паразитът.
Цитология
Оцветяването по Гимза се използва и за цитологично изследване на ендоцервикални проби, въпреки че не е най-широко използваната техника за тази цел.
Въпреки това, в случаи на недостиг на ресурси, може да се използва, предлагайки подобна функционалност на цитонамазката и на по-ниска цена. Изисква обаче експертни познания от лекаря, който извършва изследването.
Цитогенетика
Ключова характеристика на оцветяването по Гимза е способността му да се свързва силно с региони на ДНК, богати на аденин и тимин. Това позволява визуализирането на ДНК по време на клетъчна митоза, в различни състояния на кондензация.
Тези изследвания са необходими за откриване на хроматични аберации, като дупликации, делеции или транслокации на различни области на хромозомите.
Изследване, демонстриращо ефективността на оцветяването по Гимза
Cannova et al (2016) сравняват три техники за оцветяване за диагностициране на кожна лайшманиоза.
За тази цел са използвани проби, получени от експериментално животно ( Мезокрисетус ауратус) експериментално инокулирани с лейшмании.
Авторите демонстрираха, че оцветяването по Гимза е по-добро от оцветяването по Pap-mart® и Gaffney. Поради това те считат оцветяването по Гимза за идеално за диагностициране на кожна лайшманиоза.
Отличните резултати, получени от авторите, се дължат на факта, че комбинацията от багрила, съставляващи сместа на Гимза, има необходимите условия за създаване на благоприятен контраст, което прави възможно ясното разграничаване на структурите на амастиготите, както интра-, така и екстрацелуларно.
Другите техники (Pap-mart® и Gaffney) също направиха това, но по-слаб начин и следователно по-трудни за визуализиране. Ето защо оцветяването по Giemsa се препоръчва за паразитологична диагноза на лайшманиоза.
По подобен начин, проучване на Ramírez et al (1994) оценява валидността на оцветяванията по Giemsa и Lendrum в конюнктивални натривки за идентифициране на Chlamydia trachomatis.
Авторите установиха, че оцветяванията по Гимза и Ледрум имат еднаква специфичност, но Гимза се оказа по-чувствителен.
Това обяснява защо оцветяването по Гимза в момента е най-често използваното за диагностициране на хламидиални инфекции, особено в условия с ограничени ресурси.
Препоръки за добро оцветяване
Листата не трябва да се сушат твърде бързо. Трябва да изчакате необходимото време, за да ги изсушите на въздух. Приблизително 2 часа.
За най-добри резултати оцветете веднага след 2 часа.
За да се втвърдят и смесят по-добре петната, пробата трябва да се разнесе върху листа на тънък, равномерен слой.
Предпочитаната кръвна проба е капилярната, тъй като намазката се взема директно от капка кръв и следователно пробата не съдържа никакви добавки, което благоприятства поддържането на клетъчните структури.
Ако обаче се използва венозна кръв, като антикоагулант трябва да се използва EDTA, а не хепарин, тъй като последният обикновено деформира клетките.
Често срещани грешки при оцветяване по Гимза
При използването на тази техника на оцветяване могат да се допуснат грешки. Те се проявяват чрез резки промени в нюанса на структурата.
Изключително синьо оцветяване
Може да се дължи на:
- Много дебели петна
- Превишаване на времето за оцветяване
- Измийте недостатъчно.
- Използване на реагенти с pH значително над неутралното (алкално).
При тези условия цветовете на следните структури се изкривяват, така че еритроцитите, вместо да оцветят в сьомгово-розово, ще станат зелени, еозинофилните гранули, които би трябвало да са оцветени в тухленочервено, ще станат синкави или сиви и т.н. отклонение от обичайните нюанси.
Прекалено розово оцветяване
Може да се дължи на:
- Недостатъчно време за оцветяване.
- Продължително или прекомерно миене.
- Не е много сухо
- Използване на силно киселинни реагенти.
В този конкретен случай структурите, които обикновено са оцветени в синьо, ще бъдат едва видими, докато структурите, които са оцветени в розово, ще имат много преувеличени нюанси.
Пример: Червените кръвни клетки ще изглеждат яркочервени или наситено оранжеви, ядреният хроматин ще изглежда бледорозов, а еозинофилните гранули ще се оцветят в яркочервено.
Наличие на утайки в намазката
Причините могат да бъдат:
- Използвайте мръсни или лошо изпрани чаршафи.
- Не оставяйте петното да изсъхне добре.
- Оставете фиксиращия разтвор за дълго време.
- Неправилно измиване в края на оцветяването.
- Недостатъчна филтрация или липса на филтрация на използваното багрило.
Наличие на морфологични артефакти
В петната могат да се появят морфологични артефакти, което затруднява визуализирането и интерпретацията на структурите. Това е така, защото:
- Видът на използвания антикоагулант, като хепарин.
- Използване на мръсни, повредени или мазни листа.
Режим на съхранение
След приготвяне, багрилото трябва да се съхранява на стайна температура (15-25°C), за да се предотврати утаяването му. Съхранявайте в плътно затворен кехлибарен контейнер.
Позоваването
- Cannova D, Brito E и Simons M. Оценка на техниките за оцветяване за диагностициране на кожна лайшманиоза. Salus . 2016 г .; 20 (2): 24-29.
- PanReac Applichem реактиви ITW. Оцветяване по Гимза. Версия 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Кастелар дел Валес, Испания.
- Кларк Г. Процедури за оцветяване (1981), 4-то издание. Williams & Willkins.
- Приложна клинична химия. Оцветяване по Гимза за диагностика витро Дистрибутор: cromakit.es
- Рамирес И., Мехия М., Гарсия де ла Рива Х., Хермес Ф. и Грациозо К. Валидност на оцветяванията по Гимза и Лендрум в конюнктивални натривки за идентифициране на Chlamydia trachomatis. Купата Санит Панам. 1994 г .; 116 (3): 212-216.
- Casas-Rincón G. Обща микология. 1994. 2-ро изд. Централен университет на Венецуела, библиотечни издания. Венецуела, Каракас
- «Оцветяване по Гимза». Уикипедия, Свободната енциклопедия 1 септември 2017 г., 01:02 UTC. 6 декември 2018 г., en.wikipedia.org.