Giemsovo barvení je technika používaná v mikrobiologii a cytogenetice k barvení buněk a tkání, která umožňuje vizualizaci specifických struktur. Giemsovo barvení, vyvinuté Gustavem Giemsou v roce 1904, je jednou z nejrozšířenějších technik v diagnostických laboratořích k identifikaci mikroorganismů, parazitů a chromozomů.
Barvení Giemsou vyžaduje materiály, jako je Giemsovo barvivo, methanol a destilovaná voda. Technika zahrnuje fixaci buněk na podložní sklíčka a následnou aplikaci Giemsova barviva zředěného v methanolu. Po obarvení se buňky promyjí destilovanou vodou a pozorují se pod mikroskopem.
Mezi hlavní využití Giemsova barvení patří identifikace patogenů, jako je Plasmodium (které způsobuje malárii), Trypanosoma (která způsobuje Chagasovu chorobu), a bakterií, jako jsou Chlamydie a Rickettsie. Giemsovo barvení se dále široce používá v analýze chromozomů k diagnostice genetických onemocnění a identifikaci chromozomálních abnormalit.
Podrobný návod k efektivnímu provedení barvení Giemsou.
Giemsovo barvení je základní technikou v klinických analýzách a vědeckých výzkumných laboratořích. Umožňuje vizualizaci různých buněčných struktur, jako jsou chromozomy, paraziti a bakterie, prostřednictvím specifického barvení jejich složek. V tomto článku si krok za krokem vysvětlíme, jak efektivně provádět Giemsovo barvení.
Krok 1: Připravte si Giemsův roztok, který lze zakoupit hotový nebo připravit z prášku. Roztok by měl být zředěn destilovanou vodou v poměru doporučeném výrobcem.
Krok 2: Vzorek fixujte na podložní sklíčko pomocí tepla nebo fixačních prostředků, jako je etylalkohol. Ujistěte se, že je vzorek bezpečně upevněn, aby se během barvení nedošlo k jeho deformaci.
Krok 3: Fixovaný preparát pokryjte Giemsovým roztokem a ujistěte se, že je celý povrch rovnoměrně pokryt. Sklíčko nechte v kontaktu s roztokem po určitou dobu, obvykle mezi 10 a 30 minutami.
Krok 4: Opláchněte sklíčko pod tekoucí vodou, abyste odstranili přebytečné barvivo. Jemně sklíčko osušte savým papírem nebo stlačeným vzduchem.
Krok 5: Obarvený vzorek pozorujte pod světelným mikroskopem s použitím vhodných zvětšovacích objektivů. Giemsovo barvení umožní vizualizaci buněčných struktur s větší jasností a kontrastem.
Barvení Giemsou se široce používá v různých oblastech biologie a medicíny, jako je diagnostika parazitárních onemocnění, analýza krevních buněk a identifikace infekčních agens. Správným dodržováním výše popsaných kroků lze dosáhnout přesných a spolehlivých výsledků barvení Giemsou.
Pochopte podrobně proces barvení Giemsa a jeho fungování.
Giemsovo barvení je metoda široce používaná v mikrobiologických a hematologických laboratořích pro vizualizaci buněčných struktur a detekci patogenů. Tato metoda, kterou v roce 1902 vyvinul Gustav Giemsa, je založena na afinitě bazických a kyselých barviv k různým buněčným složkám.
Mezi materiály potřebné pro Giemsovo barvení patří Giemsovo barvivo, fixační a odbarvovací roztoky, podložní sklíčka, krycí sklíčka a mikroskop. Giemsovo barvivo je směs methylenové modři, eosinu a glycerinu a používá se k barvení jaderných a cytoplazmatických struktur buněk.
Giemsova barvicí technika zahrnuje fixaci buněk na podložní sklíčko a následnou aplikaci Giemsova barviva po stanovenou dobu. Po obarvení se buňky promyjí destilovanou vodou a odbarví se, aby se odstranilo přebytečné barvivo. Nakonec se sklíčka vysuší a pozorují pod mikroskopem.
Mezi hlavní využití Giemsova barvení patří identifikace parazitů přenášených krví, jako jsou Plasmodium spp., a diferenciace krevních buněk v nátěrech periferní krve. Tato metoda se dále široce používá k identifikaci bakterií, virů a dalších patogenů v klinických vzorcích.
Jeho fungování je založeno na afinitě bazických a kyselých barviv k různým buněčným složkám, což poskytuje jasné a detailní snímky pod mikroskopem.
Pochopte patologicko-anatomický postup s Giemsovým barvením pro klinickou analýzu.
Giemsovo barvení je technika používaná v anatomické patologii pro klinickou analýzu vzorků tkání. Toto barvivo, vyvinuté německým vědcem Gustavem Giemsou, je široce používáno díky své schopnosti zvýraznit různé buněčné složky, jako jsou jádra, chromozomy a paraziti.
Barvení Giemsou vyžaduje řadu materiálů, včetně barviva Giemsa, metylalkoholu, fyziologického roztoku a podložních sklíček. Postup zahrnuje fixaci vzorku v metylalkoholu, aplikaci barviva Giemsa a promytí fyziologickým roztokem. Po obarvení se vzorky pozorují pod mikroskopem k analýze.
Giemsovo barvení se široce používá v laboratořích anatomické patologie k identifikaci různých patologií, jako jsou parazitární infekce, leukémie a autoimunitní onemocnění. Tato technika umožňuje podrobnou analýzu buněčných struktur, což usnadňuje klinickou diagnózu a sledování léčby.
Jeho použití je nezbytné pro diagnostiku a léčbu různých onemocnění, což z něj činí nepostradatelnou techniku pro zdravotnické pracovníky.
Identifikace barviva použitého k barvení krevního nátěru.
Giemsovo barvení je běžná metoda používaná k pozorování různých typů krevních buněk v krevním nátěru. Hlavním barvivem používaným v tomto procesu je Giemsovo barvení, což je směs methylenové modři, eosinu a azurového barviva B. Toto barvivo je obzvláště účinné při barvení struktur, jako jsou buněčná jádra, chromozomy a cytoplazmatické inkluze.
Giemsova barva: podklad, materiály, technika a použití
O Giemsovo barvení je typ barvení klinických vzorků, založený na směsi kyselých a zásaditých barviv. Jeho vznik byl inspirován prací Romanowského, kterou Gustav Giemsa, německý chemik a bakteriolog, zdokonalil přidáním glycerolu ke stabilizaci sloučenin.
Změny provedené v původní Romanowského technice nám umožnily značně zlepšit mikroskopická pozorování; proto byla technika pojmenována Giemsovo barvení.
Protože se jedná o jednoduchou, vysoce funkční a ekonomickou techniku, je v současnosti široce používána v klinické laboratoři pro hematologické nátěry, vzorky kostní dřeně a tkáňové řezy.
Giemsova barvicí technika je velmi užitečná pro cytologické studie, protože umožňuje pozorování specifických buněčných struktur. Tato technika barví cytoplazmy, jádra, jadérka, vakuoly a granula buněk a je schopna rozlišit jemné stopy chromatinu.
Dále lze detekovat významné změny ve velikosti, tvaru nebo barvě jádra, kde je možné vizualizovat ztrátu vztahu mezi jádrem a cytoplazmou.
Na druhou stranu umožňuje identifikaci nezralých buněk v kostní dřeni a periferní krvi, což je důležité pro diagnostiku závažných onemocnění, jako je leukémie. Umožňuje také detekci hemoparazitů, extracelulárních a intracelulárních bakterií, hub a dalších patogenů.
V cytogenetice se široce používá, protože je možné studovat buněčnou mitózu.
Giemsa mořicí make-up
Barviva Romanowského typu využívají kontrast mezi kyselými a zásaditými barvivy k barvení zásaditých a kyselých struktur. Jak je vidět, kyselá barviva mají afinitu k barvení zásaditých struktur a naopak.
Základním používaným barvivem je methylenová modř a její oxidované deriváty (Azure A a Azure B), zatímco kyselým barvivem je eosin.
Kyselé struktury buněk jsou mimo jiné nukleové kyseliny, segmentované bazofilní granule, takže se barví methylenovou modří.
Ve stejném smyslu jsou základními strukturami buněk hemoglobin a některé granule, jako jsou ty obsažené v segmentovaných eosinofilech, mimo jiné; Ty budou obarveny eosinem.
Na druhou stranu, protože methylenová modř a nebeská modř jsou charakterizovány jako metachromatická barviva, mohou poskytovat různým strukturám proměnlivý tón v závislosti na polyanionovém náboji, který mají.
Takto může strategická kombinace zásaditých a kyselých barviv vyvinout široké spektrum barev, v závislosti na biochemických vlastnostech každé struktury, od odstínů světle modré, tmavě modré, šeříkové a fialové v případě kyselých struktur.
I když je barva poskytovaná eosinem stabilnější, vytváří barvy mezi červenooranžovou a lososovou.
Materiály
Materiály pro přípravu zásobního roztoku
Příprava zásobního roztoku vyžaduje navážení 600 mg práškového barviva Giemsa, odměření 500 ml methylalkoholu bez acetonu a 50 ml neutrálního glycerinu.
Způsob přípravy zásobního roztoku
Odvážený Giemsův prášek dejte do hmoždíře. Pokud se v něm vyskytnou hrudky, rozdrťte je. Poté přidejte značné množství odměřeného glycerinu a důkladně promíchejte. Výslednou směs nalijte do velmi čisté jantarové lahve.
Zbývající glycerin se přidá do malty. Znovu se promíchá, aby se odstranilo zbývající barvivo, které ulpělo na stěnách malty, a poté se nalije do stejné lahve.
Láhev se zakryje a přepravuje se 2 hodiny ve vodní lázni při 55 °C. Během pobytu ve vodní lázni směs každou půlhodinu lehce promíchejte.
Směs se poté nechá vychladnout, než se přidá alkohol. Část odměřeného alkoholu se nejprve přidá do malty, aby se dokončilo vymytí zbývajícího barviva, a poté se přidá do směsi spolu se zbývajícím alkoholem.
Tento přípravek by měl být ponechán zrát alespoň 2 týdny. Část použitá v matečném louhu by měla být přefiltrována.
Aby se zabránilo kontaminaci přípravku, doporučuje se převést část, která bude neustále používána, do malé jantarové lahvičky s kapátkem. Doplňte pokaždé, když je činidlo vyčerpáno.
Materiály pro přípravu pufrovacího roztoku
Na druhou stranu, pufrovací roztok o pH 7,2 se připraví takto:
6,77 g bezvodého fosforečnanu sodného (zvážený NaHPO 4 ), 2,59 g dihydrogenfosforečnanu draselného (KH 2 PO 4 ) a destilovanou vodou do objemu 1000 ml.
Konečná příprava barviva
Pro přípravu finálního barvicího roztoku se odměří 2 ml přefiltrovaného zásobního roztoku a smíchá se s 6 ml pufrovacího roztoku. Směs se protřepe.
Jednou z důležitých skutečností, kterou je třeba vzít v úvahu, je, že techniky přípravy barviv se mohou lišit v závislosti na komerčním zařízení.
Další materiály potřebné k vytvoření barvy
Kromě popsaných materiálů nesmí chybět barevné můstky, trička s vodou nebo tampon na praní prádla, prostěradla s předměty nebo potahy, časovač pro kontrolu doby barvení a savý papír nebo nějaký materiál, který slouží k schnutí (gáza nebo vata).
Technika
Proces barvení
1) Před barvením musí být vzorek rozetřen na čisté podložní sklíčko.
Vzorky mohou být krev, kostní dřeň, histologické řezy tkáně nebo cervikálně-vaginální vzorky. Doporučuje se, aby pasty byly tenké a před barvením se nechaly 1 až 2 hodiny schnout.
2) Na omalovánku se umístí všechny barevné listy. Funguje to vždy ve stejném pořadí a každý list je jasně označen.
3) Na nátěr kápněte několik kapek 100% methylalkoholu (methanolu) a nechte působit 3 až 5 minut, aby se vzorek fixoval a dehydratoval.
4) Z listu vylijte methanol a nechte jej uschnout na vzduchu.
5) Po zaschnutí přidejte kapátkem finální barvicí roztok, dokud nebude pokryt celý list. Nechte působit 15 minut. Někteří autoři doporučují až 25 minut. Záleží na obchodě.
6) Sceďte barvivo a promyjte nátěr destilovanou vodou nebo pufrovacím roztokem podle bodu 7.2.
7) Na savém papíru nechte listy uschnout na vzduchu, uspořádané svisle s pomocí podložky.
8) Otřete zadní stranu sklíčka gázovým tamponem nebo vatovým tamponem namočeným v alkoholu, abyste odstranili veškeré barvivo.
utility
Giemsova barvicí technika se používá v několika oblastech, včetně hematologie, mykologie, bakteriologie, parazitologie, cytologie a cytogenetiky.
Hematologie
Toto je nejběžnější použití tohoto barviva. S jeho pomocí lze identifikovat každou buňku přítomnou ve vzorcích kostní dřeně nebo periferní krve. Kromě odhadu počtu buněk v každé sérii dokáže detekovat leukocytózu nebo leukopenii, trombocytopenii atd.
Protože je citlivý na identifikaci nezralých buněk, je užitečný při diagnostice akutní nebo chronické leukémie. Může také diagnostikovat anémie, jako je mimo jiné srpkovitá anémie.
Mykologie
V této oblasti je běžné používat Histoplasma capsulatum (intracelulární dimorfní houba) ve vzorcích tkání.
Bakteriologie
V hematologických nátěrech barvených Giemsou je možné detekovat Borrelie u pacientů s onemocněním zvaným recidivující horečka. Spirochety jsou hojně pozorovány mezi erytrocyty ve vzorcích odebraných na vrcholu horečky.
Je také možné vizualizovat intracelulární bakterie jako Rickettsia sp. e Chlamydia trachomatis v infikovaných buňkách.
Parazitologie
V oblasti parazitologie umožnilo Giemsovo barvení diagnostiku parazitárních onemocnění, jako je malárie, Chagasova choroba a leishmanióza.
U prvních dvou parazitů, Plasmodium sp e Trypanosoma cruzi, v periferní krvi infikovaných pacientů a lze je nalézt v různých stádiích v závislosti na stádiu onemocnění.
Pro zlepšení vyhledávání parazitů v krvi se doporučuje použít Giemsovo barvivo smíchané s May-Grünwaldovým barvivem.
Podobně lze kožní leishmaniózu diagnostikovat vyhodnocením vzorků kožní biopsie barvených Giemsou, kde se parazit nachází.
Citologie
Giemsovo barvení se používá také pro cytologické studium endocervikálních vzorků, ačkoli to není pro tento účel nejrozšířenější technika.
V případech nedostatku zdrojů jej však lze použít, protože nabízí podobnou funkčnost jako stěr z cystického papíru a je levnější. Vyžaduje však odborné znalosti vyšetřujícího lékaře.
Cytogenetika
Klíčovou vlastností Giemsova barvení je jeho schopnost silně se vázat na oblasti DNA bohaté na adenin a thymin. To umožňuje vizualizaci DNA během buněčné mitózy, v různých stavech kondenzace.
Tyto studie jsou nezbytné k detekci chromatických aberací, jako jsou duplikace, delece nebo translokace různých oblastí chromozomů.
Výzkum prokazující účinnost barvení Giemsou
Cannova a kol. (2016) porovnali tři barvicí techniky pro diagnostiku kožní leishmaniózy.
Pro tento účel byly použity vzorky získané od experimentálního zvířete ( (Mesocrisetus auratus) experimentálně naočkovaných leishmánií.
Autoři prokázali, že Giemsovo barvení bylo lepší než barvení Pap-mart® a Gaffney. Proto považovali Giemsovo barvení za ideální pro diagnostiku kožní leishmaniózy.
Vynikající výsledky, kterých autoři dosáhli, jsou dány skutečností, že kombinace barviv, která tvoří Giemsovu směs, má nezbytné podmínky pro vytvoření příznivého kontrastu, což umožňuje jasné rozlišení struktur amastigotů, a to jak intra-, tak extracelulárně.
Ostatní techniky (Pap-mart® a Gaffney) totéž dokázaly, ale slabším způsobem, a proto je obtížnější je vizualizovat. Proto se pro parazitologickou diagnostiku leishmaniózy doporučuje barvení Giemsa.
Podobně studie Ramíreze a kol. (1994) hodnotila platnost barvení Giemsa a Lendrum v konjunktiválních nátěrech pro identifikaci Chlamydia trachomatis.
Autoři zjistili, že Giemsovo a Ledrumovo barvení mají stejnou specificitu, ale Giemsovo barvení se ukázalo jako citlivější.
To vysvětluje, proč je Giemsovo barvení v současnosti nejčastěji používaným metodou pro diagnostiku chlamydiových infekcí, zejména v oblastech s omezenými zdroji.
Doporučení pro dobré barvení
Listy by se neměly sušit příliš rychle. Měli byste počkat, až budou dostatečně dlouho uschlé na vzduchu. Přibližně 2 hodiny.
Pro dosažení nejlepších výsledků vybarvujte ihned po 2 hodinách.
Aby mořidla lépe zaschla a promíchala se, měl by být vzorek rozetřen po celém listu v tenké, rovnoměrné vrstvě.
Preferovaný vzorek krve je kapilární, protože nátěr se odebírá přímo z kapky krve, a proto vzorek neobsahuje žádné přísady, což podporuje zachování buněčných struktur.
Pokud se však používá žilní krev, měla by se jako antikoagulant použít EDTA a nikoli heparin, protože ten obvykle deformuje buňky.
Časté chyby při barvení Giemsou
Při použití této barvicí techniky se mohou dělat chyby. Ty se projevují náhlými změnami odstínu struktury.
Extrémně modré zbarvení
Může to být způsobeno:
- Velmi silné skvrny
- Překročení doby barvení
- Nedostatečně perte.
- Použití činidel s pH výrazně nad neutrálním (alkalickým) pH.
Za těchto podmínek se barvy následujících struktur zkreslují, takže erytrocyty místo lososově růžového zbarvení zezelenají, eozinofilní granula, která by měla být cihlově červená, se zbarví do modra nebo šeda atd. dochází k odchylce od obvyklých odstínů.
Příliš růžové zbarvení
Může to být způsobeno:
- Nedostatečná doba barvení.
- Dlouhodobé nebo nadměrné mytí.
- Není moc suché
- Použití velmi kyselých činidel.
V tomto konkrétním případě budou struktury, které jsou normálně zbarvené modře, sotva viditelné, zatímco struktury, které jsou zbarvené růžově, budou mít velmi výrazné odstíny.
Příklad: Červené krvinky se budou jevit jasně červené nebo tmavě oranžové, jaderný chromatin bude světle růžový a eosinofilní granula se zbarví jasně červeně.
Přítomnost sraženin v nátěru
Příčiny mohou být:
- Používejte špinavé nebo špatně vyprané prostěradla.
- Nenechte skvrnu dobře zaschnout.
- Nechte fixační roztok působit delší dobu.
- Nesprávné mytí na konci barvení.
- Nedostatečná filtrace nebo žádná filtrace použitého barviva.
Přítomnost morfologických artefaktů
V barvách se mohou objevit morfologické artefakty, které ztěžují vizualizaci a interpretaci struktur. Je to proto, že:
- Typ použitého antikoagulancia, například heparin.
- Použití špinavých, poškozených nebo mastných listů.
Režim úložiště
Po přípravě by se barvivo mělo uchovávat při pokojové teplotě (15–25 °C), aby se zabránilo jeho srážení. Skladujte v těsně uzavřené jantarové nádobě.
Odkazy
- Cannova D, Brito E a Simons M. Hodnocení barvicích technik pro diagnostiku kožní leishmaniózy. Salus . 2016; 20 (2): 24-29.
- PanReac Applichem Reagents ITW. Barvení Giemsa. Verze 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Španělsko.
- Clark G. Barvicí postupy (1981), 4. vydání. Williams & Willkins.
- Aplikovaná klinická chemie. Giemsovo barvení pro diagnostiku. in vitro Distributor: cromakit.es
- Ramírez I, Mejía M, García de la Riva J, Hermes F a Grazioso C. Validita barvení Giemsa a Lendrum v konjunktiválních nátěrech pro identifikaci Chlamydia trachomatis. Miska Sanit Panam. 1994; 116(3): 212-216.
- Casas-Rincón G. Obecná mykologie. 1994. 2nd Ed. Central University of Venezuela, Library Editions. Venezuela, Caracas
- „Barvení dle Giemsy.“ Wikipedie, volná encyklopedie 1. září 2017 v 01:02 UTC. 6. prosince 2018, en.wikipedia.org.