Giemsa-farvning er en teknik, der anvendes i mikrobiologi og cytogenetik til at farve celler og væv, hvilket muliggør visualisering af specifikke strukturer. Giemsa-farvning, der blev udviklet af Gustav Giemsa i 1904, er en af de mest anvendte teknikker i diagnostiske laboratorier til at identificere mikroorganismer, parasitter og kromosomer.
Giemsa-farvning kræver materialer som Giemsa-farvning, methanol og destilleret vand. Teknikken involverer fiksering af celler på objektglas, efterfulgt af påføring af Giemsa-farvning fortyndet i methanol. Efter farvning vaskes cellerne i destilleret vand og observeres under et mikroskop.
De primære anvendelser af Giemsa-farvning omfatter identifikation af patogener såsom Plasmodium (som forårsager malaria), Trypanosoma (som forårsager Chagas sygdom) og bakterier såsom Chlamydia og Rickettsia. Derudover er Giemsa-farvning meget anvendt i kromosomanalyse til at diagnosticere genetiske sygdomme og identificere kromosomale abnormiteter.
Trin-for-trin-guide til effektiv udførelse af Giemsa-farvning.
Giemsa-farvning er en essentiel teknik i klinisk analyse og videnskabelige forskningslaboratorier. Den muliggør visualisering af forskellige cellulære strukturer, såsom kromosomer, parasitter og bakterier, gennem specifik farvning af deres komponenter. I denne artikel forklarer vi trin for trin, hvordan man udfører Giemsa-farvning effektivt.
1 Trin: Forbered en Giemsa-opløsning, som kan købes færdiglavet eller fremstilles som pulver. Opløsningen skal fortyndes i destilleret vand i producentens anbefalede forhold.
2 Trin: Fastgør prøven til et objektglas med varme eller fikseringsmidler, såsom ethylalkohol. Sørg for, at prøven er forsvarligt fikseret for at undgå deformation under farvning.
3 Trin: Dæk den fikserede prøve med Giemsa-opløsning, og sørg for, at hele overfladen er jævnt dækket. Lad objektglasset være i kontakt med opløsningen i en bestemt periode, normalt mellem 10 og 30 minutter.
4 Trin: Skyl objektglasset under rindende vand for at fjerne overskydende plet. Tør forsigtigt objektglasset med absorberende papir eller trykluft.
5 Trin: Observer den farvede prøve under et lysmikroskop med passende forstørrelsesglas. Giemsa-farvning vil muliggøre visualisering af cellulære strukturer med større klarhed og kontrast.
Giemsa-farvning anvendes i vid udstrækning inden for forskellige områder af biologi og medicin, såsom diagnosticering af parasitsygdomme, analyse af blodlegemer og identifikation af infektiøse agenser. Ved at følge ovenstående trin korrekt kan man opnå nøjagtige og pålidelige Giemsa-farvningsresultater.
Forstå Giemsa-farvningsprocessen og hvordan den fungerer i detaljer.
Giemsa-farvning er en metode, der er meget anvendt i mikrobiologiske og hæmatologiske laboratorier til visualisering af cellulære strukturer og detektering af patogener. Denne metode, der blev udviklet af Gustav Giemsa i 1902, er baseret på affiniteten af basiske og sure farvestoffer for forskellige cellulære komponenter.
De nødvendige materialer til Giemsa-farvning omfatter Giemsa-farvning, fikserings- og affarvningsopløsninger, præparater, dækglas og et mikroskop. Giemsa-farvning er en blanding af methylenblåt, eosin og glycerin og bruges til at farve cellernes kerne- og cytoplasmatiske strukturer.
Giemsa-farvningsteknikken involverer fiksering af celler på et præparat, efterfulgt af påføring af Giemsa-farvning i en bestemt periode. Efter farvning vaskes cellerne med destilleret vand og affarves for at fjerne overskydende farvestof. Til sidst tørres præparaterne og observeres under et mikroskop.
De primære anvendelser af Giemsa-farvning omfatter identifikation af blodbårne parasitter, såsom Plasmodium spp., og differentiering af blodlegemer i perifere blodudstrygninger. Desuden er denne metode i vid udstrækning anvendt til identifikation af bakterier, vira og andre patogener i kliniske prøver.
Dens funktion er baseret på affiniteten af basiske og sure farvestoffer med forskellige cellulære komponenter, hvilket giver klare og detaljerede billeder under mikroskopet.
Forstå den patologiske anatomiske procedure med Giemsa-farvning til klinisk analyse.
Giemsa-farvning er en teknik, der anvendes i anatomisk patologi til klinisk analyse af vævsprøver. Denne farvning, der blev udviklet af den tyske videnskabsmand Gustav Giemsa, er meget anvendt på grund af dens evne til at fremhæve forskellige cellulære komponenter, såsom kerner, kromosomer og parasitter.
Giemsa-farvning kræver en række materialer, herunder Giemsa-farvning, methylsprit, saltvandsopløsning og objektglas. Proceduren involverer fiksering af prøven i methylsprit, påføring af Giemsa-farvning og vask med saltvandsopløsning. Efter farvning observeres prøverne under et mikroskop til analyse.
Giemsa-farvning anvendes i vid udstrækning i anatomiske patologilaboratorier til at identificere forskellige patologier, såsom parasitinfektioner, leukæmi og autoimmune sygdomme. Teknikken muliggør detaljeret analyse af cellulære strukturer, hvilket letter klinisk diagnose og behandlingsovervågning.
Dens anvendelse er afgørende for diagnosticering og behandling af forskellige sygdomme, hvilket gør den til en uundværlig teknik for sundhedspersonale.
Identifikation af det farvestof, der bruges til at farve et blodudstrygning.
Giemsa-farvning er en almindelig metode, der bruges til at observere forskellige typer blodlegemer i et blodudstrygning. Det primære farvestof, der anvendes i denne proces, er Giemsa-plet, som er en blanding af methylenblåt, eosin og azurblåt B. Dette farvestof er særligt effektivt til farvning af strukturer såsom cellekerner, kromosomer og cytoplasmatiske inklusioner.
Giemsa-bejdse: fundament, materialer, teknik og anvendelser
O Giemsa-plet er en type farvning til kliniske prøver, baseret på en blanding af sure og basiske farvestoffer. Dens skabelse blev inspireret af Romanowskys arbejde, hvor Gustav Giemsa, en tysk kemiker og bakteriolog, perfektionerede den ved at tilsætte glycerol for at stabilisere forbindelserne.
Ændringerne i Romanowskys oprindelige teknik gjorde det muligt for os at forbedre mikroskopiske observationer betydeligt; derfor blev teknikken kaldt Giemsa-farvning.
Fordi det er en simpel, yderst funktionel og økonomisk teknik, anvendes den i øjeblikket i vid udstrækning i det kliniske laboratorium til hæmatologiske smears, knoglemarvsprøver og vævssnit.
Giemsa-farvningsteknikken er meget nyttig til cytologiske undersøgelser, da den muliggør observation af specifikke cellulære strukturer. Denne teknik farver cytoplasmer, kerner, nukleoler, vakuoler og granuler i celler og gør det muligt at skelne fine spor af kromatin.
Desuden kan betydelige ændringer i kernens størrelse, form eller farve detekteres, hvor det er muligt at visualisere tabet af forholdet mellem kerne og cytoplasma.
På den anden side muliggør det identifikation af umodne celler i knoglemarven og det perifere blod, hvilket er vigtigt for diagnosticering af alvorlige sygdomme såsom leukæmi. Det muliggør også detektion af hæmoparasitter, ekstracellulære og intracellulære bakterier, svampe og andre patogener.
Inden for cytogenetik er det meget anvendt, da det er muligt at studere cellemitose.
Giemsa farvefoundation
Romanowsky-type farvninger bruger en kontrast mellem sure og basiske farvestoffer til at farve henholdsvis basiske og sure strukturer. Som det kan ses, har sure farvestoffer en affinitet til at farve basiske strukturer og omvendt.
Det anvendte basiske farvestof er methylenblåt og dets oxiderede derivater (Azur A og Azure B), mens det sure farvestof er eosin.
Cellernes sure strukturer er blandt andet nukleinsyrer, segmenterede basofilgranuler, så de er farvet med methylenblåt.
På samme måde er cellernes grundlæggende strukturer hæmoglobin og nogle granuler, såsom dem, der findes i segmenterede eosinofiler, blandt andre; disse vil blive farvet med eosin.
På den anden side, da methylenblåt og himmelblå er karakteriseret som metakromatiske farvestoffer, kan de give en variabel tone til forskellige strukturer i henhold til den polyanionladning, de besidder.
Sådan kan den strategiske kombination af basiske og sure farvestoffer udvikle et bredt spektrum af farver, afhængigt af de biokemiske egenskaber ved hver struktur, lige fra nuancer af lyseblå, mørkeblå, lilla og lilla i tilfælde af sure strukturer.
Mens farven fra eosin er mere stabil, genererer den farver mellem rødlig orange og laksefarvet.
Materialer
Materialer til fremstilling af stamopløsningen
Forberedelse af stamopløsningen kræver afvejning af 600 mg Giemsa-pulverfarvestof, afmåling af 500 ml acetonefri methylalkohol og 50 ml neutral glycerin.
Fremgangsmåde til fremstilling af stamopløsningen
Kom det afvejede Giemsa-pulver i en morter. Hvis der er klumper, skal de pulveriseres. Tilsæt derefter en anselig mængde af den afmålte glycerin og bland grundigt. Hæld den resulterende blanding i en meget ren, ravfarvet flaske.
Den resterende glycerin tilsættes mørtlen. Bland igen for at fjerne eventuelt resterende farvestof, der har sat sig fast på mørtelvæggene, og hæld det derefter i den samme flaske.
Flasken dækkes og transporteres i 2 timer i et vandbad ved 55 °C. Rør blandingen let hver halve time, mens den er i vandbadet.
Blandingen får derefter lov til at køle af, før alkoholen tilsættes. En del af den afmålte alkohol tilsættes først mørtlen for at vaske eventuelt resterende farvestof væk, og tilsættes derefter blandingen sammen med den resterende alkohol.
Denne blanding skal modnes i mindst 2 uger. Den del, der bruges i moderluden, skal filtreres.
For at undgå kontaminering af præparatet anbefales det at overføre den del, der skal bruges konstant, til en lille, ravfarvet flaske med pipette. Genopfyld hver gang reagenset er brugt op.
Materialer til fremstilling af bufferopløsningen
På den anden side fremstilles en bufferopløsning ved pH 7,2 som følger:
6,77 g natriumphosphat (vandfrit) (vejet NaHPO 4 ), 2,59 g kaliumdihydrogenfosfat (KH 2 PO 4 ), og destilleret vand op til 1000 ml.
Endelig farvestofforberedelse
For at forberede den endelige farvningsopløsning afmåles 2 ml af den filtrerede stamopløsning og blandes med 6 ml af bufferopløsningen. Blandingen rystes.
En relevant kendsgerning, der skal tages i betragtning, er, at teknikkerne til farvestofforberedelse kan variere afhængigt af den kommercielle installation.
Yderligere materialer nødvendige for at lave farvelægningen
Ud over de beskrevne materialer skal der være farvede broer, t-shirts med vand eller en tampon til vask af tøj, lagner med genstande eller betræk, en timer til at styre farvetiden og duppe papiret eller et materiale, der tjener til at tørre (gasbind eller bomuld).
teknik
Farveproces
1) Før farvning skal prøven fordeles på et rent præparat.
Prøverne kan være blod, knoglemarv, histologiske vævssnit eller cervikal-vaginale prøver. Det anbefales, at pastaerne er tynde og får lov til at tørre i 1 til 2 timer før farvning.
2) På en farvelægningsbro placeres alle de farvede blade. Det fungerer altid i samme rækkefølge, og hvert blad er tydeligt mærket.
3) Dryp et par dråber 100% methylalkohol (methanol) på udstrygningen, og lad den virke i 3 til 5 minutter for at fiksere og dehydrere prøven.
4) Kassér den metanol, der er til stede på bladet, og lad det lufttørre.
5) Når det er tørt, tilsættes den sidste farveopløsning med en pipette, indtil hele bladet er dækket. Lad det virke i 15 minutter. Nogle forfattere anbefaler op til 25 minutter. Det afhænger af butikken.
6) Hæld vandet fra pletten, og vask udstrygningen med destilleret vand eller en bufferopløsning i 7.2.
7) Lad bladene lufttørre på absorberende papir, arrangeret lodret ved hjælp af en støtte.
8) Tør bagsiden af objektglasset af med en gazebind eller vatpind dyppet i alkohol for at fjerne eventuelt farvestof.
forsyningsselskaber
Giemsa-farvningsteknikken anvendes inden for flere områder, herunder: hæmatologi, mykologi, bakteriologi, parasitologi, cytologi og cytogenetik.
Hæmatologi
Dette er den mest almindelige anvendelse af denne farvning. Med den kan hver eneste celle, der findes i knoglemarven eller perifere blodprøver, identificeres. Udover at estimere antallet af celler i hver serie kan den detektere leukocytose eller leukopeni, trombocytopeni osv.
Fordi den er følsom over for identifikation af umodne celler, er den nyttig til at diagnosticere akut eller kronisk leukæmi. Den kan også diagnosticere anæmier såsom seglcelleanæmi, blandt andre.
Mykologi
I dette område er det almindeligt at bruge Histoplasma capsulatum (intracellulær dimorf svamp) i vævsprøver.
Bakteriologi
I hæmatologiske udstrygningsprøver farvet med Giemsa er det muligt at detektere Borrelias sp. hos patienter med en sygdom kaldet recidiverende feber. Spirokæter observeres rigeligt blandt erytrocytter i prøver indsamlet ved feberens højdepunkt.
Det er også muligt at visualisere intracellulære bakterier som Rickettsia sp. e Chlamydia trachomatis i inficerede celler.
Parasitologi
Inden for parasitologi har Giemsa-farvning muliggjort diagnosticering af parasitsygdomme som malaria, Chagas sygdom og leishmaniasis.
I de to første parasitter, Plasmodium sp. e Trypanosoma cruzi, kan henholdsvis ses i det perifere blod hos inficerede patienter og kan findes i forskellige stadier afhængigt af sygdomsstadiet.
For at forbedre søgningen efter parasitter i blodet anbefales det at bruge Giemsa-farvning blandet med May-Grünwald-farvning.
Tilsvarende kan kutan leishmaniasis diagnosticeres ved at evaluere Giemsa-farvede hudbiopsiprøver, hvor parasitten findes.
Cytologi
Giemsa-farvning bruges også til cytologisk undersøgelse af endocervikale prøver, selvom det ikke er den mest anvendte teknik til dette formål.
I tilfælde af ressourceknaphed kan den dog bruges, da den tilbyder lignende funktionalitet som en celleprøve og til en lavere pris. Det kræver dog ekspertise fra undersøgeren.
Cytogenetik
Et centralt træk ved Giemsa-farvning er dens evne til at binde stærkt til DNA-regioner, der er rige på adenin og thymin. Dette gør det muligt at visualisere DNA under cellemitose i forskellige kondensationstilstande.
Disse undersøgelser er nødvendige for at detektere kromatiske aberrationer, såsom duplikationer, deletioner eller translokationer af forskellige områder af kromosomerne.
Forskning der demonstrerer effektiviteten af Giemsa-farvning
Cannova et al. (2016) sammenlignede tre farvningsteknikker til diagnosticering af kutan leishmaniasis.
Til dette formål blev der anvendt prøver fra et forsøgsdyr ( Mesocristetus auratus) eksperimentelt inokuleret med Leishmanias.
Forfatterne viste, at Giemsa-farvning var bedre end Pap-mart® og Gaffney-farvning. Derfor anså de Giemsa-farvning for at være ideel til diagnosticering af kutan leishmaniasis.
De fremragende resultater, som forfatterne har opnået, skyldes, at kombinationen af farvestoffer, der udgør Giemsa-blandingen, har de nødvendige betingelser for at skabe en gunstig kontrast, hvilket gør det muligt tydeligt at skelne amastigoternes strukturer, både intra- og ekstracellulært.
De andre teknikker (Pap-mart® og Gaffney) gjorde også dette, men på en svagere måde og derfor vanskeligere at visualisere. Derfor anbefales Giemsa-farvning til den parasitologiske diagnose af leishmaniasis.
Tilsvarende evaluerede et studie af Ramírez et al. (1994) validiteten af Giemsa- og Lendrum-farvninger i konjunktivaludstrygninger til identifikation af Chlamydia trachomatis.
Forfatterne fastslog, at Giemsa- og Ledrum-farvninger har samme specificitet, men Giemsa viste sig at være mere følsom.
Dette forklarer, hvorfor Giemsa-farvning i øjeblikket er den hyppigst anvendte metode til diagnosticering af klamydiale infektioner, især i ressourcefattige miljøer.
Anbefalinger til god farvning
Bladene bør ikke tørres for hurtigt. Du bør vente i den passende mængde tid til at lufttørre dem. Cirka 2 timer.
Farv straks efter 2 timer for det bedste resultat.
For at pletterne kan hærde og blandes bedre, bør prøven fordeles ud over arket i et tyndt, jævnt lag.
Den foretrukne blodprøve er kapillær, da udstryget tages direkte fra bloddråben, og prøven derfor ikke indeholder nogen tilsætningsstoffer, hvilket favoriserer vedligeholdelsen af cellulære strukturer.
Hvis der anvendes venøst blod, bør EDTA dog anvendes som antikoagulant og ikke heparin, da sidstnævnte normalt deformerer cellerne.
Almindelige fejl i Giemsa-farvning
Når man bruger denne farveteknik, kan der opstå fejl. Disse viser sig ved pludselige ændringer i strukturens farvetone.
Ekstremt blå farve
Det kan skyldes:
- Meget tykke pletter
- Overskridelse af farvetiden
- Vask utilstrækkeligt.
- Brug af reagenser med en pH-værdi langt over neutral (alkalisk)
Under disse forhold forvrænges farverne på de følgende strukturer, således at erytrocytter, i stedet for at farve lakserøde, bliver grønne, eosinofilgranuler, som burde være farvet teglrøde, bliver blålige eller grå osv. afvigelse fra de sædvanlige nuancer.
Overdreven lyserød farve
Det kan skyldes:
- Utilstrækkelig farvningstid.
- Langvarig eller overdreven vask.
- Ikke særlig tør
- Brug af meget sure reagenser.
I dette specifikke tilfælde vil strukturer, der normalt er tonet blå, næsten ikke være synlige, mens strukturer, der er tonet lyserøde, vil have meget overdrevne nuancer.
Eksempel: Røde blodlegemer vil fremstå lyserøde eller dyb orange, nuklear kromatin vil fremstå lyserød, og eosinofilgranuler vil farves lyserøde.
Tilstedeværelse af bundfald i udstrygning
Årsagerne kan være:
- Brug snavsede eller dårligt vaskede lagner.
- Lad ikke pletten tørre godt.
- Lad fikseringsopløsningen virke i lang tid.
- Forkert vask ved afslutningen af farvningen.
- Utilstrækkelig filtrering eller ingen filtrering af det anvendte farvestof.
Tilstedeværelse af morfologiske artefakter
Morfologiske artefakter kan forekomme i farvningerne, hvilket gør det vanskeligt at visualisere og fortolke strukturerne. Dette skyldes:
- Type af antikoagulant, der anvendes, såsom heparin.
- Brug af snavsede, beskadigede eller olieagtige blade.
Lagringstilstand
Efter tilberedning skal farvestoffet opbevares ved stuetemperatur (15-25 °C) for at forhindre udfældning af farvestoffet. Det skal opbevares i en tæt lukket, ravfarvet beholder.
Referencer
- Cannova D, Brito E og Simons M. Evaluering af farvningsteknikker til diagnosticering af kutan leishmaniasis. Salus . 2016; 20 (2): 24-29.
- PanReac Applichem Reagents ITW. Giemsa farvning. Version 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Spanien.
- Clark G. Farvningsprocedurer (1981), 4. udgave. Williams & Willkins.
- Anvendt klinisk kemi. Giemsa-farvning til diagnostik vitro Distributør: cromakit.es
- Ramírez I, Mejía M, García de la Riva J, Hermes F og Grazioso C. Gyldighed af Giemsa- og Lendrum-farvninger i konjunktivaludstrygninger til identifikation af Chlamydia trachomatis. Sanit Panam skål. 1994; 116(3): 212-216.
- Casas-Rincón G. Generel mykologi. 1994. 2. udg. Central University of Venezuela, Library Editions. Venezuela, Caracas
- «Giemsa-farvning.» Wikipedia, Den Frie Encyklopædi 1. september 2017 kl. 01:02 UTC. 6. december 2018, en.wikipedia.org.