Die Giemsa-Färbung ist eine in der Mikrobiologie und Zytogenetik verwendete Technik zum Färben von Zellen und Geweben, um die Visualisierung spezifischer Strukturen zu ermöglichen. Die 1904 von Gustav Giemsa entwickelte Giemsa-Färbung ist eine der am häufigsten verwendeten Techniken in diagnostischen Laboren zur Identifizierung von Mikroorganismen, Parasiten und Chromosomen.
Für die Giemsa-Färbung werden Materialien wie Giemsa-Farbstoff, Methanol und destilliertes Wasser benötigt. Bei dieser Technik werden Zellen auf Objektträgern fixiert und anschließend mit in Methanol verdünntem Giemsa-Farbstoff behandelt. Nach der Färbung werden die Zellen mit destilliertem Wasser gespült und unter dem Mikroskop beobachtet.
Zu den Hauptanwendungen der Giemsa-Färbung gehört die Identifizierung von Krankheitserregern wie Plasmodium (Erreger der Malaria), Trypanosoma (Erreger der Chagas-Krankheit) und Bakterien wie Chlamydien und Rickettsien. Darüber hinaus wird die Giemsa-Färbung häufig in der Chromosomenanalyse zur Diagnose genetischer Erkrankungen und zur Identifizierung von Chromosomenanomalien eingesetzt.
Schritt-für-Schritt-Anleitung zur effektiven Durchführung der Giemsa-Färbung.
Die Giemsa-Färbung ist eine unverzichtbare Technik in klinischen Analysen und wissenschaftlichen Forschungslaboren. Sie ermöglicht die Visualisierung verschiedener Zellstrukturen wie Chromosomen, Parasiten und Bakterien durch die spezifische Färbung ihrer Bestandteile. In diesem Artikel erklären wir Schritt für Schritt, wie die Giemsa-Färbung effektiv durchgeführt wird.
Schritt 1: Bereiten Sie eine Giemsa-Lösung vor, die Sie fertig kaufen oder aus Pulver herstellen können. Die Lösung sollte im vom Hersteller empfohlenen Verhältnis mit destilliertem Wasser verdünnt werden.
Schritt 2: Fixieren Sie die Probe mit Hitze oder Fixiermitteln wie Ethylalkohol auf einem Objektträger. Stellen Sie sicher, dass die Probe sicher fixiert ist, um eine Verformung während der Färbung zu vermeiden.
Schritt 3: Bedecken Sie die fixierte Probe mit Giemsa-Lösung und stellen Sie sicher, dass die gesamte Oberfläche gleichmäßig bedeckt ist. Lassen Sie den Objektträger für einen bestimmten Zeitraum, normalerweise zwischen 10 und 30 Minuten, in der Lösung.
Schritt 4: Spülen Sie den Objektträger unter fließendem Wasser ab, um überschüssigen Schmutz zu entfernen. Trocknen Sie den Objektträger vorsichtig mit saugfähigem Papier oder Druckluft.
Schritt 5: Beobachten Sie die gefärbte Probe unter einem Lichtmikroskop mit geeigneten Vergrößerungsobjektiven. Die Giemsa-Färbung ermöglicht eine klarere und kontrastreichere Visualisierung der Zellstrukturen.
Die Giemsa-Färbung wird in verschiedenen Bereichen der Biologie und Medizin eingesetzt, beispielsweise zur Diagnose parasitärer Erkrankungen, zur Analyse von Blutzellen und zur Identifizierung von Infektionserregern. Durch korrektes Befolgen der oben beschriebenen Schritte können genaue und zuverlässige Ergebnisse der Giemsa-Färbung erzielt werden.
Verstehen Sie den Giemsa-Färbeprozess und seine Funktionsweise im Detail.
Die Giemsa-Färbung ist eine in mikrobiologischen und hämatologischen Laboren weit verbreitete Methode zur Visualisierung von Zellstrukturen und zum Nachweis von Krankheitserregern. Diese 1902 von Gustav Giemsa entwickelte Methode basiert auf der Affinität basischer und saurer Farbstoffe zu verschiedenen Zellbestandteilen.
Für die Giemsa-Färbung werden die Giemsa-Färbung, Fixier- und Entfärbelösungen, Objektträger, Deckgläser und ein Mikroskop benötigt. Die Giemsa-Färbung ist eine Mischung aus Methylenblau, Eosin und Glycerin und wird zur Färbung der Kern- und Zytoplasmastrukturen von Zellen verwendet.
Bei der Giemsa-Färbung werden Zellen auf einem Objektträger fixiert und anschließend für einen bestimmten Zeitraum mit Giemsa-Farbstoff gefärbt. Nach der Färbung werden die Zellen mit destilliertem Wasser gewaschen und entfärbt, um überschüssigen Farbstoff zu entfernen. Anschließend werden die Objektträger getrocknet und unter dem Mikroskop betrachtet.
Zu den Hauptanwendungen der Giemsa-Färbung gehören die Identifizierung von durch Blut übertragbaren Parasiten wie Plasmodium spp. und die Differenzierung von Blutzellen in peripheren Blutausstrichen. Darüber hinaus wird diese Methode häufig zur Identifizierung von Bakterien, Viren und anderen Krankheitserregern in klinischen Proben eingesetzt.
Seine Funktionsweise basiert auf der Affinität basischer und saurer Farbstoffe zu verschiedenen Zellbestandteilen und liefert unter dem Mikroskop klare und detaillierte Bilder.
Verstehen Sie das pathologische Anatomieverfahren mit der Giemsa-Färbung für die klinische Analyse.
Die Giemsa-Färbung ist eine Technik, die in der anatomischen Pathologie zur klinischen Analyse von Gewebeproben eingesetzt wird. Diese vom deutschen Wissenschaftler Gustav Giemsa entwickelte Färbung wird häufig eingesetzt, da sie verschiedene Zellbestandteile wie Zellkerne, Chromosomen und Parasiten hervorhebt.
Für die Giemsa-Färbung werden verschiedene Materialien benötigt, darunter Giemsa-Färbung, Brennspiritus, Kochsalzlösung und Glasobjektträger. Das Verfahren umfasst das Fixieren der Probe in Brennspiritus, das Auftragen der Giemsa-Färbung und das Waschen mit Kochsalzlösung. Nach der Färbung werden die Proben zur Analyse unter dem Mikroskop untersucht.
Die Giemsa-Färbung wird in pathologischen Laboren häufig zur Identifizierung verschiedener Pathologien wie parasitären Infektionen, Leukämie und Autoimmunerkrankungen eingesetzt. Die Technik ermöglicht eine detaillierte Analyse zellulärer Strukturen und erleichtert so die klinische Diagnose und die Behandlungsüberwachung.
Ihr Einsatz ist für die Diagnose und Behandlung verschiedener Krankheiten von entscheidender Bedeutung und macht sie zu einer unverzichtbaren Technik für medizinisches Fachpersonal.
Identifizierung des Farbstoffs, der zum Färben eines Blutausstrichs verwendet wird.
Die Giemsa-Färbung ist eine gängige Methode zur Beobachtung verschiedener Blutzellen in einem Blutausstrich. Der wichtigste Farbstoff, der bei diesem Verfahren verwendet wird, ist Giemsa-Färbung, eine Mischung aus Methylenblau, Eosin und Azur B. Dieser Farbstoff ist besonders wirksam beim Färben von Strukturen wie Zellkernen, Chromosomen und zytoplasmatischen Einschlüssen.
Giemsa-Färbung: Grundlagen, Materialien, Technik und Anwendung
O Giemsa-Färbung ist eine Färbungsmethode für klinische Proben, die auf einer Mischung aus sauren und basischen Farbstoffen basiert. Ihre Entwicklung wurde von der Arbeit Romanowskys inspiriert, wo Gustav Giemsa, ein deutscher Chemiker und Bakteriologe, sie durch die Zugabe von Glycerin zur Stabilisierung der Verbindungen perfektionierte.
Die an Romanowskys ursprünglicher Technik vorgenommenen Änderungen ermöglichten uns eine erhebliche Verbesserung der mikroskopischen Beobachtungen; daher wurde die Technik Giemsa-Färbung genannt.
Da es sich um eine einfache, hochfunktionelle und wirtschaftliche Technik handelt, wird sie derzeit im klinischen Labor häufig für hämatologische Abstriche, Knochenmarkproben und Gewebeschnitte verwendet.
Die Giemsa-Färbung ist für zytologische Untersuchungen sehr nützlich, da sie die Beobachtung spezifischer Zellstrukturen ermöglicht. Mit dieser Technik werden Zytoplasma, Zellkerne, Nukleoli, Vakuolen und Granula von Zellen gefärbt, wodurch feine Chromatinspuren erkennbar werden.
Darüber hinaus lassen sich signifikante Veränderungen der Größe, Form oder Farbe des Zellkerns erkennen, wodurch der Verlust der Zellkern-Zytoplasma-Beziehung sichtbar gemacht werden kann.
Andererseits ermöglicht es die Identifizierung unreifer Zellen im Knochenmark und im peripheren Blut, was für die Diagnose schwerer Krankheiten wie Leukämie wichtig ist. Es ermöglicht auch den Nachweis von Hämoparasiten, extrazellulären und intrazellulären Bakterien, Pilzen und anderen Krankheitserregern.
In der Zytogenetik wird es häufig verwendet, da es die Untersuchung der Zellmitose ermöglicht.
Giemsa Fleckengrundierung
Bei Färbungen vom Romanowsky-Typ wird ein Kontrast zwischen sauren und basischen Farbstoffen verwendet, um basische bzw. saure Strukturen zu färben. Wie man sieht, färben saure Farbstoffe bevorzugt basische Strukturen und umgekehrt.
Als basischer Farbstoff wird Methylenblau und dessen oxidierte Derivate (Azur A und Azur B) verwendet, als saurer Farbstoff wird Eosin verwendet.
Bei den sauren Strukturen der Zellen handelt es sich unter anderem um Nukleinsäuren und segmentierte basophile Granula, weshalb sie mit Methylenblau angefärbt werden.
In diesem Sinne sind die Grundstrukturen von Zellen Hämoglobin und einige Granula, wie sie unter anderem in segmentierten Eosinophilen enthalten sind; diese werden mit Eosin gefärbt.
Da Methylenblau und Himmelblau andererseits als metachromatische Farbstoffe charakterisiert sind, können sie je nach der Ladung ihres Polyanions unterschiedlichen Strukturen einen variablen Farbton verleihen.
Auf diese Weise kann durch die strategische Kombination von basischen und sauren Farbstoffen ein breites Farbspektrum entsprechend den biochemischen Eigenschaften der einzelnen Strukturen entstehen, das von Hellblau-, Dunkelblau-, Flieder- und Violetttönen bei sauren Strukturen reicht.
Während die durch Eosin erzeugte Farbe stabiler ist, erzeugt sie Farben zwischen rötlich-orange und lachsfarben.
Materialien
Materialien zur Herstellung der Stammlösung
Zur Herstellung der Stammlösung müssen 600 mg Giemsa-Pulverfärbung abgewogen, 500 ml acetonfreier Methylalkohol und 50 ml neutrales Glycerin abgemessen werden.
Methode zur Herstellung der Stammlösung
Geben Sie das abgewogene Giemsa-Pulver in einen Mörser. Eventuelle Klumpen sollten zerkleinert werden. Geben Sie anschließend eine großzügige Menge des abgemessenen Glycerins hinzu und verrühren Sie alles gründlich. Gießen Sie die Mischung in eine sehr saubere Bernsteinflasche.
Das restliche Glycerin wird dem Mörtel hinzugefügt. Nochmals umrühren, um alle Farbstoffreste zu entfernen, die an den Mörtelwänden haften geblieben sind, und anschließend in dieselbe Flasche füllen.
Die Flasche wird abgedeckt und für 2 Stunden in einem Wasserbad bei 55 °C transportiert. Während des Aufenthalts im Wasserbad wird die Mischung jede halbe Stunde leicht umgerührt.
Anschließend lässt man die Mischung abkühlen, bevor man den Alkohol hinzugibt. Ein Teil des abgemessenen Alkohols wird zunächst in den Mörser gegeben, um alle Farbstoffreste auszuwaschen, und dann zusammen mit dem restlichen Alkohol zur Mischung hinzugefügt.
Dieses Präparat sollte mindestens 2 Wochen reifen. Der in der Mutterlauge verwendete Anteil sollte gefiltert werden.
Um eine Kontamination des Präparats zu vermeiden, wird empfohlen, den ständig verwendeten Teil in eine kleine Bernsteinflasche mit Pipette umzufüllen. Füllen Sie jedes Mal nach, wenn das Reagenz aufgebraucht ist.
Materialien zur Herstellung der Pufferlösung
Andererseits wird eine Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,2 wie folgt hergestellt:
6,77 g Natriumphosphat (wasserfrei) (gewogen NaHPO 4 ), 2,59 g Kaliumdihydrogenphosphat (KH 2 PO 4 ) und destilliertes Wasser bis zu 1000 ml.
Endgültige Farbstoffvorbereitung
Zur Herstellung der endgültigen Färbelösung werden 2 ml der gefilterten Stammlösung abgemessen und mit 6 ml der Pufferlösung vermischt. Die Mischung wird geschüttelt.
Eine relevante Tatsache, die berücksichtigt werden muss, ist, dass sich die Farbstoffvorbereitungstechniken je nach kommerzieller Anlage ändern können.
Zusätzliche Materialien, die zum Färben benötigt werden
Zusätzlich zu den beschriebenen Materialien müssen farbige Brücken, T-Shirts mit Wasser oder ein Tampon zum Waschen von Kleidung, Laken mit Gegenständen oder Abdeckungen, ein Timer zum Steuern der Färbungszeit und ein Löschpapier oder ein Material zum Trocknen (Gaze oder Baumwolle) vorhanden sein.
Technik
Färbungsprozess
1) Vor dem Färben muss die Probe auf einem sauberen Objektträger ausgebreitet werden.
Als Proben kommen Blut, Knochenmark, histologische Gewebeschnitte oder zervikal-vaginale Proben infrage. Es wird empfohlen, die Pasten dünnflüssig zu machen und sie vor dem Färben 1 bis 2 Stunden trocknen zu lassen.
2) Auf einer Malbrücke werden alle bunten Blätter abgelegt. Dabei wird immer die gleiche Reihenfolge eingehalten und jedes Blatt ist eindeutig beschriftet.
3) Geben Sie einige Tropfen 100 % Methylalkohol (Methanol) auf den Ausstrich und lassen Sie ihn 3 bis 5 Minuten einwirken, um die Probe zu fixieren und zu dehydrieren.
4) Entfernen Sie das auf dem Blatt vorhandene Methanol und lassen Sie es an der Luft trocknen.
5) Sobald das Blatt trocken ist, geben Sie die endgültige Färbelösung mit einer Pipette hinzu, bis das gesamte Blatt bedeckt ist. Lassen Sie die Lösung 15 Minuten einwirken. Manche Autoren empfehlen bis zu 25 Minuten. Das hängt vom jeweiligen Geschäft ab.
6) Lassen Sie den Fleck abtropfen und waschen Sie den Ausstrich mit destilliertem Wasser oder einer Pufferlösung gemäß 7.2.
7) Lassen Sie die Blätter auf saugfähigem Papier an der Luft trocknen, wobei Sie sie mithilfe einer Unterlage vertikal anordnen.
8) Wischen Sie die Rückseite des Objektträgers mit einem in Alkohol getauchten Mulltupfer oder Wattestäbchen ab, um jeglichen Farbstoff zu entfernen.
Dienstprogramme
Die Giemsa-Färbetechnik wird in mehreren Bereichen eingesetzt, darunter: Hämatologie, Mykologie, Bakteriologie, Parasitologie, Zytologie und Zytogenetik.
Hämatologie
Dies ist die häufigste Anwendung dieser Färbung. Mit ihr kann jede einzelne Zelle im Knochenmark oder in peripheren Blutproben identifiziert werden. Neben der Schätzung der Zellzahl in jeder Serie kann damit auch Leukozytose oder Leukopenie, Thrombozytopenie usw. nachgewiesen werden.
Da es unreife Zellen erkennt, ist es nützlich bei der Diagnose von akuter oder chronischer Leukämie. Es kann auch Anämien wie Sichelzellenanämie und andere diagnostizieren.
Pilzkunde
In diesem Bereich ist es üblich, Histoplasma capsulatum (intrazellulärer dimorpher Pilz) in Gewebeproben.
Bakteriologie
In mit Giemsa gefärbten hämatologischen Ausstrichen kann man erkennen Borrelien sp bei Patienten mit einer Krankheit namens Rückfallfieber. In Proben, die auf dem Höhepunkt des Fiebers entnommen wurden, wurden in großer Zahl Spirochäten zwischen den Erythrozyten beobachtet.
Es ist auch möglich, intrazelluläre Bakterien zu visualisieren als Rickettsia sp e Chlamydia trachomatis in infizierten Zellen.
Parasitologie
Im Bereich der Parasitologie hat die Giemsa-Färbung die Diagnose parasitärer Erkrankungen wie Malaria, Chagas-Krankheit und Leishmaniose ermöglicht.
Bei den ersten beiden Parasiten Plasmodium sp e Trypanosoma cruzi, sind im peripheren Blut infizierter Patienten nachweisbar und können je nach Krankheitsstadium in unterschiedlichen Stadien auftreten.
Um die Suche nach Parasiten im Blut zu verbessern, wird empfohlen, die Giemsa-Färbung gemischt mit der May-Grünwald-Färbung zu verwenden.
Ebenso kann die Diagnose einer kutanen Leishmaniose durch die Auswertung von Giemsa-gefärbten Hautbiopsieproben, in denen der Parasit gefunden wurde, gestellt werden.
Zytologie
Die Giemsa-Färbung wird auch für die zytologische Untersuchung endozervikaler Proben verwendet, obwohl sie für diesen Zweck nicht die am häufigsten verwendete Technik ist.
Bei Ressourcenknappheit kann es jedoch eingesetzt werden, da es ähnliche Funktionen wie der Pap-Abstrich bietet und weniger kostet. Allerdings erfordert es die Fachkompetenz des Untersuchenden.
Zytogenetik
Ein Hauptmerkmal der Giemsa-Färbung ist ihre Fähigkeit, stark an DNA-Regionen zu binden, die reich an Adenin und Thymin sind. Dadurch kann DNA während der Zellmitose in verschiedenen Kondensationszuständen visualisiert werden.
Diese Untersuchungen sind notwendig, um chromatische Aberrationen wie Duplikationen, Deletionen oder Translokationen verschiedener Chromosomenbereiche zu erkennen.
Forschung zum Nachweis der Wirksamkeit der Giemsa-Färbung
Cannova et al. (2016) verglichen drei Färbetechniken zur Diagnose der kutanen Leishmaniose.
Zu diesem Zweck wurden Proben eines Versuchstiers verwendet ( Mesocrisetus auratus) experimentell mit Leishmanien geimpft.
Die Autoren zeigten, dass die Giemsa-Färbung der Pap-mart®- und Gaffney-Färbung überlegen war. Daher hielten sie die Giemsa-Färbung für ideal zur Diagnose der kutanen Leishmaniose.
Die hervorragenden Ergebnisse der Autoren sind darauf zurückzuführen, dass die Farbstoffkombination der Giemsa-Mischung die notwendigen Voraussetzungen für einen günstigen Kontrast bietet, der eine klare Unterscheidung der Strukturen der Amastigoten sowohl intra- als auch extrazellulär ermöglicht.
Die anderen Techniken (Pap-mart® und Gaffney) taten dies ebenfalls, allerdings in schwächerer Form und daher schwieriger zu visualisieren. Aus diesem Grund wird die Giemsa-Färbung für die parasitologische Diagnose der Leishmaniose empfohlen.
In ähnlicher Weise untersuchte eine Studie von Ramírez et al. (1994) die Gültigkeit von Giemsa- und Lendrum-Färbungen in Bindehautabstrichen zur Identifizierung von Chlamydia trachomatis.
Die Autoren stellten fest, dass Giemsa- und Ledrum-Färbungen die gleiche Spezifität aufweisen, Giemsa sich jedoch als empfindlicher erwies.
Dies erklärt, warum die Giemsa-Färbung derzeit am häufigsten zur Diagnose von Chlamydieninfektionen verwendet wird, insbesondere in ressourcenarmen Umgebungen.
Empfehlungen für eine gute Farbgebung
Die Blätter sollten nicht zu schnell getrocknet werden. Sie sollten die entsprechende Zeit abwarten, bis sie an der Luft getrocknet sind. Ungefähr 2 Stunden.
Für beste Ergebnisse sofort nach 2 Stunden färben.
Damit die Flecken besser haften und sich vermischen, sollte die Probe in einer dünnen, gleichmäßigen Schicht auf dem Blatt verteilt werden.
Die bevorzugte Blutprobe ist eine Kapillarblutprobe, da der Abstrich direkt aus dem Blutstropfen entnommen wird und die Probe daher keine Zusätze enthält, was die Erhaltung der Zellstrukturen begünstigt.
Bei der Verwendung von venösem Blut sollte jedoch EDTA als Antikoagulans verwendet werden und nicht Heparin, da letzteres in der Regel zu einer Deformation der Zellen führt.
Häufige Fehler bei der Giemsa-Färbung
Bei dieser Färbetechnik können Fehler passieren, die sich durch plötzliche Farbänderungen der Struktur bemerkbar machen.
Extrem blaue Färbung
Dies kann folgende Ursachen haben:
- Sehr dicke Flecken
- Überschreitung der Färbezeit
- Unzureichend waschen.
- Verwendung von Reagenzien mit einem pH-Wert deutlich über dem neutralen (alkalischen) Wert.
Unter diesen Bedingungen werden die Farben der folgenden Strukturen verzerrt, so dass Erythrozyten nicht lachsrosa, sondern grün werden, eosinophile Granula, die ziegelrot gefärbt werden sollten, bläulich oder grau werden usw. Abweichung von den üblichen Farbtönen.
Übermäßig rosa Färbung
Dies kann folgende Ursachen haben:
- Unzureichende Färbezeit.
- Längeres oder übermäßiges Waschen.
- Nicht sehr trocken
- Verwendung sehr saurer Reagenzien.
In diesem speziellen Fall sind Strukturen, die normalerweise blau getönt sind, kaum sichtbar, während Strukturen, die rosa getönt sind, sehr übertriebene Farbtöne aufweisen.
Beispiel: Rote Blutkörperchen erscheinen leuchtend rot oder tief orange, Kernchromatin erscheint blass rosa und eosinophile Granula färben sich leuchtend rot.
Vorhandensein von Niederschlägen im Ausstrich
Die Ursachen können sein:
- Verwenden Sie schmutzige oder schlecht gewaschene Bettwäsche.
- Lassen Sie den Fleck nicht gut eintrocknen.
- Lassen Sie die Fixierlösung längere Zeit einwirken.
- Unsachgemäßes Waschen am Ende des Färbens.
- Unzureichende oder keine Filtration des verwendeten Farbstoffs.
Vorhandensein morphologischer Artefakte
In den Flecken können morphologische Artefakte auftreten, die die Visualisierung und Interpretation der Strukturen erschweren. Dies liegt daran, dass:
- Art des verwendeten Antikoagulans, z. B. Heparin.
- Verwendung von schmutzigen, beschädigten oder öligen Blättern.
Speichermodus
Nach der Herstellung sollte der Farbstoff bei Raumtemperatur (15–25 °C) aufbewahrt werden, um eine Ausfällung des Farbstoffs zu verhindern. Er sollte in einem fest verschlossenen Bernsteinbehälter aufbewahrt werden.
Referenzen
- Cannova D, Brito E und Simons M. Bewertung von Färbetechniken zur Diagnose der kutanen Leishmaniose. Salus . 2016; 20 (2): 24-29.
- PanReac Applichem Reagents ITW. Giemsa-Färbung. Version 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Spanien.
- Clark G. Färbeverfahren (1981), 4. Williams & Willkins.
- Angewandte Klinische Chemie. Giemsa-Färbung für die Diagnostik in vitro . Vertrieb: cromakit.es
- Ramírez I, Mejía M, García de la Riva J, Hermes F und Grazioso C. Gültigkeit von Giemsa- und Lendrum-Färbungen in Bindehautabstrichen zur Identifizierung von Chlamydia trachomatis. Sanit Panam Schüssel. 1994; 116 (3): 212 & ndash; 216.
- Casas-Rincón G. Allgemeine Mykologie. 1994. 2. Aufl. Zentrale Universität von Venezuela, Bibliotheksausgaben. Venezuela, Caracas
- «Giemsa-Färbung.» Wikipedia, die freie Enzyklopädie . 1. September 2017, 01:02 UTC. 6. Dezember 2018, en.wikipedia.org.