Giemsa värvimine on mikrobioloogias ja tsütogeneetikas kasutatav meetod rakkude ja kudede värvimiseks, mis võimaldab visualiseerida spetsiifilisi struktuure. Gustav Giemsa poolt 1904. aastal välja töötatud Giemsa värvimine on üks enimkasutatavaid tehnikaid diagnostilistes laborites mikroorganismide, parasiitide ja kromosoomide tuvastamiseks.
Giemsa värvimiseks on vaja selliseid materjale nagu Giemsa värv, metanool ja destilleeritud vesi. Meetod hõlmab rakkude kinnitamist klaasplaatidele, millele järgneb metanoolis lahjendatud Giemsa värvi pealekandmine. Pärast värvimist pestakse rakke destilleeritud veega ja uuritakse mikroskoobi all.
Giemsa värvimise peamised kasutusalad hõlmavad selliste patogeenide nagu Plasmodium (mis põhjustab malaariat), Trypanosoma (mis põhjustab Chagase tõbe) ja bakterite nagu Chlamydia ja Rickettsia tuvastamist. Lisaks kasutatakse Giemsa värvimist laialdaselt kromosoomianalüüsis geneetiliste haiguste diagnoosimiseks ja kromosomaalsete kõrvalekallete tuvastamiseks.
Samm-sammult juhend Giemsa värvimise tõhusaks teostamiseks.
Giemsa värvimine on kliinilise analüüsi ja teaduslaborite oluline tehnika. See võimaldab visualiseerida mitmesuguseid rakustruktuure, näiteks kromosoome, parasiite ja baktereid, nende komponentide spetsiifilise värvimise kaudu. Selles artiklis selgitame samm-sammult, kuidas Giemsa värvimist tõhusalt läbi viia.
Samm 1: Valmistage ette Giemsa lahus, mida saab osta valmis kujul või pulbrist. Lahus tuleb lahjendada destilleeritud veega tootja soovitatud vahekorras.
Samm 2: Kinnitage proov klaasslaidile kuumuse või fikseerivate ainete, näiteks etüülalkoholi abil. Veenduge, et proov on kindlalt kinnitatud, et vältida moonutusi värvimise ajal.
Samm 3: Kata fikseeritud proov Giemsa lahusega, veendudes, et kogu pind on ühtlaselt kaetud. Jätke slaid lahusega kokku kindlaks ajaks, tavaliselt 10 kuni 30 minutiks.
Samm 4: Loputage slaidi voolava vee all, et eemaldada liigne plekk. Kuivatage slaid õrnalt imava paberi või suruõhuga.
Samm 5: Vaadake värvitud proovi valgusmikroskoobi all, kasutades sobivaid suurendusobjektiive. Giemsa värvimine võimaldab visualiseerida rakustruktuure suurema selguse ja kontrastsusega.
Giemsa värvimist kasutatakse laialdaselt erinevates bioloogia ja meditsiini valdkondades, näiteks parasiithaiguste diagnoosimisel, vererakkude analüüsimisel ja nakkustekitajate tuvastamisel. Ülaltoodud samme õigesti järgides saab Giemsa värvimise tulemusi täpselt ja usaldusväärselt.
Saage aru Giemsa värvimisprotsessist ja selle toimimisest üksikasjalikumalt.
Giemsa värvimine on mikrobioloogia ja hematoloogia laborites laialdaselt kasutatav meetod rakustruktuuride visualiseerimiseks ja patogeenide tuvastamiseks. Gustav Giemsa poolt 1902. aastal välja töötatud meetod põhineb aluseliste ja happeliste värvainete afiinsusel erinevate rakuliste komponentide suhtes.
Giemsa värvimiseks vajalike materjalide hulka kuuluvad Giemsa värv, fikseerimis- ja värvieemaldamislahused, slaidid, katteklaasid ja mikroskoop. Giemsa värv on metüleensinise, eosiini ja glütseriini segu ning seda kasutatakse rakkude tuuma- ja tsütoplasmaatiliste struktuuride värvimiseks.
Giemsa värvimise tehnika hõlmab rakkude kinnitamist slaidile, millele järgneb Giemsa värvi pealekandmine kindlaksmääratud aja jooksul. Pärast värvimist pestakse rakke destilleeritud veega ja värvitustatakse, et eemaldada liigne värv. Lõpuks slaidid kuivatatakse ja uuritakse mikroskoobi all.
Giemsa värvimise peamised kasutusalad hõlmavad vere kaudu levivate parasiitide, näiteks Plasmodium spp., tuvastamist ja vererakkude diferentseerimist perifeerse vere määrdumisel. Lisaks kasutatakse seda meetodit laialdaselt bakterite, viiruste ja muude patogeenide tuvastamiseks kliinilistes proovides.
Selle toimimine põhineb aluseliste ja happeliste värvainete afiinsusel erinevate rakuliste komponentidega, pakkudes mikroskoobi all selgeid ja detailseid pilte.
Mõista patoloogilise anatoomia protseduuri Giemsa värvimisega kliiniliseks analüüsiks.
Giemsa värvimine on anatoomilises patoloogias kasutatav tehnika koeproovide kliiniliseks analüüsiks. Saksa teadlase Gustav Giemsa poolt välja töötatud värvimist kasutatakse laialdaselt tänu selle võimele esile tõsta mitmesuguseid rakulisi komponente, nagu tuumad, kromosoomid ja parasiidid.
Giemsa värvimiseks on vaja mitmeid materjale, sealhulgas Giemsa värvi, denatureeritud piiritust, soolalahust ja klaasslaide. Protseduur hõlmab proovi fikseerimist denatureeritud piirituses, Giemsa värvi pealekandmist ja pesemist soolalahusega. Pärast värvimist uuritakse proove mikroskoobi all analüüsimiseks.
Giemsa värvimist kasutatakse laialdaselt anatoomilise patoloogia laborites mitmesuguste patoloogiate, näiteks parasiitinfektsioonide, leukeemia ja autoimmuunhaiguste tuvastamiseks. See tehnika võimaldab rakustruktuuride detailset analüüsi, hõlbustades kliinilist diagnoosimist ja ravi jälgimist.
Selle kasutamine on oluline mitmesuguste haiguste diagnoosimiseks ja raviks, mistõttu on see tervishoiutöötajate jaoks asendamatu tehnika.
Verepreparaadi värvimiseks kasutatud värvaine identifitseerimine.
Giemsa värvimine on levinud meetod erinevat tüüpi vererakkude vaatlemiseks verepreparaatides. Peamine selles protsessis kasutatav värvaine on Giemsa plekk, mis on metüleensinise, eosiini ja azure B segu. See värvaine on eriti efektiivne selliste struktuuride nagu rakutuumad, kromosoomid ja tsütoplasmaatilised inklusioonid värvimisel.
Giemsa peits: vundament, materjalid, tehnika ja kasutusalad
O Giemsa plekk on kliiniliste proovide värvimise viis, mis põhineb happeliste ja aluseliste värvainete segul. Selle loomisele andis inspiratsiooni Romanowsky töö, kus saksa keemik ja bakterioloog Gustav Giemsa täiustas seda, lisades ühendite stabiliseerimiseks glütserooli.
Romanowsky algses tehnikas tehtud muudatused võimaldasid meil mikroskoopilisi vaatlusi märkimisväärselt parandada; seetõttu nimetati tehnikat Giemsa värvimiseks.
Kuna tegemist on lihtsa, väga funktsionaalse ja ökonoomse tehnikaga, kasutatakse seda praegu laialdaselt kliinilises laboris hematoloogiliste määrdproovide, luuüdi proovide ja koelõikude jaoks.
Giemsa värvimistehnika on tsütoloogiliste uuringute puhul väga kasulik, kuna see võimaldab jälgida spetsiifilisi rakustruktuure. See tehnika värvib rakkude tsütoplasmasid, tuumasid, nukleoole, vakuoole ja graanuleid, võimaldades eristada peeneid kromatiini jälgi.
Lisaks on võimalik tuvastada olulisi muutusi tuuma suuruses, kujus või värvuses, kus on võimalik visualiseerida tuuma ja tsütoplasma seose kadumist.
Teisest küljest võimaldab see tuvastada luuüdis ja perifeerses veres ebaküpseid rakke, mis on oluline selliste tõsiste haiguste nagu leukeemia diagnoosimisel. Samuti võimaldab see tuvastada hemoparasiite, rakuväliseid ja rakusiseseid baktereid, seeni ja muid patogeene.
Tsütogeneetikas kasutatakse seda laialdaselt, kuna on võimalik uurida rakkude mitoosi.
Giemsa peitsi jumestuskreem
Romanowsky tüüpi värvides kasutatakse happeliste ja aluseliste värvainete kontrasti vastavalt aluseliste ja happeliste struktuuride värvimiseks. Nagu näha, on happelistel värvainetel afiinsus aluseliste struktuuride värvimiseks ja vastupidi.
Kasutatav põhivärvaine on metüleensinine ja selle oksüdeeritud derivaadid (Azure A ja Azure B), happeline värvaine aga eosiin.
Rakkude happelised struktuurid on muuhulgas nukleiinhapped, segmenteeritud basofiilide graanulid, seega värvitakse neid metüleensinisega.
Samas mõttes on rakkude põhistruktuurid hemoglobiin ja mõned graanulid, näiteks need, mis sisalduvad segmenteeritud eosinofiilides; need värvitakse eosiiniga.
Teisest küljest, kuna metüleensinist ja taevasinist iseloomustatakse metakromaatiliste värvainetena, võivad nad anda erinevatele struktuuridele varieeruva tooni vastavalt nende polüanioonlaengule.
Nii saab aluseliste ja happeliste värvainete strateegiline kombinatsioon arendada laia värvispektrit, vastavalt iga struktuuri biokeemilistele omadustele, ulatudes helesinise, tumesinise, sirelililla ja lilla varjundini happeliste struktuuride puhul.
Kuigi eosiini pakutav värvus on stabiilsem, tekitab see värve punakasoranži ja lõhe vahel.
Materjalid
Põhilahuse valmistamise materjalid
Põhilahuse valmistamiseks on vaja kaaluda 600 mg Giemsa pulbervärvi, mõõta 500 ml atsetoonivaba metüülalkoholi ja 50 ml neutraalset glütseriini.
Põhilahuse valmistamise meetod
Pane kaalutud Giemsa pulber uhmrisse. Kui seal on tükke, tuleb need peenestada. Seejärel lisa arvestatav kogus mõõdetud glütseriini ja sega hoolikalt läbi. Vala saadud segu väga puhtasse merevaigukollasesse pudelisse.
Ülejäänud glütseriin lisatakse mördile. Segage uuesti, et eemaldada mördi seintele kleepunud värvainejäägid, ja valage seejärel samasse pudelisse.
Pudel kaetakse ja transporditakse 2 tundi veevannis temperatuuril 55 °C. Veevannis segage segu kergelt iga poole tunni tagant.
Seejärel lastakse segul enne alkoholi lisamist jahtuda. Osa mõõdetud alkoholist lisatakse esmalt uhmrisse, et lõplikult maha pesta kõik järelejäänud värvained, ja seejärel lisatakse see koos ülejäänud alkoholiga segule.
Sellel preparaatil tuleks lasta vähemalt 2 nädalat laagerduda. Emalahuses kasutatud osa tuleks filtreerida.
Preparaadi saastumise vältimiseks on soovitatav pidevalt kasutatav osa üle kanda väikesesse merevaigukollasesse tilgutiga pudelisse. Täitke iga kord, kui reagent on otsas.
Puhverlahuse valmistamise materjalid
Teisest küljest valmistatakse pH 7,2 puhverlahus järgmiselt:
6,77 g naatriumfosfaati (veevaba) (kaalutud NaHPOXNUMX 4 ), 2,59 g kaaliumdivesinikfosfaati (KH 2 PO 4 ) ja destilleeritud vett kuni 1000 ml-ni.
Lõplik värvimisprotsess
Lõpliku värvimislahuse valmistamiseks mõõta 2 ml filtreeritud põhilahust ja sega see 6 ml puhverlahusega. Segu loksutatakse.
Üks oluline asjaolu, mida tuleb arvesse võtta, on see, et värvimise ettevalmistusmeetodid võivad olenevalt kaubanduslikust paigaldusest erineda.
Värvimiseks vajalikud lisamaterjalid
Lisaks kirjeldatud materjalidele peavad olema värvilised sillad, veega T-särgid või tampoon riiete pesemiseks, esemete või katetega linad, taimer värvimisaja kontrollimiseks ja paberi või mõne kuivatamiseks mõeldud materjali (marli või puuvilla) imamiseks.
Tehnika
Värvimisprotsess
1) Enne värvimist tuleb proov puhtale slaidile laotada.
Proovid võivad olla veri, luuüdi, histoloogilised koelõigud või emakakaela-tupe proovid. Soovitatav on kasutada õhukesi pastasid, mis lastakse enne värvimist 1–2 tundi kuivada.
2) Värvimissillale asetatakse kõik värvilised lehed. See toimib alati samas järjekorras ja iga leht on selgelt märgistatud.
3) Tilgutage määrdumisproovile paar tilka 100% metüülalkoholi (metanooli) ja laske proovil 3–5 minutit seista, et see kinnistuks ja dehüdreeruks.
4) Eemalda lehel olev metanool ja lase õhu käes kuivada.
5) Kui leht on kuivanud, lisa tilgutiga viimane värvimislahus, kuni kogu leht on kaetud. Lase sellel 15 minutit mõjuda. Mõned autorid soovitavad kuni 25 minutit. See sõltub poest.
6) Nõruta värvaine ja pese määrdunud laik destilleeritud vee või punktis 7.2 kirjeldatud puhverlahusega.
7) Laske imaval paberil lehtedel õhu käes kuivada, asetades need toe abil vertikaalselt.
8) Pühkige slaidi tagakülge alkoholiga kastetud marlilapi või vatitupsuga, et eemaldada värvaine.
kommunaalteenused
Giemsa värvimistehnikat kasutatakse mitmes valdkonnas, sealhulgas hematoloogias, mükoloogias, bakterioloogias, parasitoloogias, tsütoloogias ja tsütogeneetikas.
Hematoloogia
See on selle värvimise kõige levinum kasutusala. Selle abil saab tuvastada iga luuüdis või perifeerse vere proovides esineva raku. Lisaks iga seeria rakkude arvu hindamisele saab sellega tuvastada leukotsütoosi või leukopeeniat, trombotsütopeeniat jne.
Kuna see on tundlik ebaküpsete rakkude tuvastamisel, on see kasulik ägeda või kroonilise leukeemia diagnoosimisel. See võib diagnoosida ka aneemiaid, näiteks sirprakulist aneemiat.
Mükoloogia
Selles piirkonnas on tavaline kasutada Histoplasma capsulatum (rakusisene dimorfne seen) koeproovides.
Bakterioloogia
Giemsaga värvitud hematoloogilistes määrdudes on võimalik tuvastada Borrelia liikide patsientidel, kellel on haigus nimega retsidiivne palavik. Palaviku haripunktis kogutud proovides on erütrotsüütide hulgas ohtralt täheldatud spirokeete.
Samuti on võimalik visualiseerida rakusiseseid baktereid kui Rickettsia sp e Chlamydia trachomatis nakatunud rakkudes.
Parasitoloogia
Parasitoloogia valdkonnas on Giemsa värvimine võimaldanud diagnoosida parasiithaigusi nagu malaaria, Chagasi tõbi ja leishmaniaas.
Kahe esimese parasiidi puhul Plasmodium sp. e Trypanosoma cruzi vastavalt võib neid näha nakatunud patsientide perifeerses veres ja neid võib leida erinevates staadiumites, olenevalt haiguse staadiumist.
Parasiitide otsimise parandamiseks verest on soovitatav kasutada Giemsa värvi, mis on segatud May-Grünwaldi värviga.
Samamoodi saab naha leishmaniaasi diagnoosida Giemsa värvitud nahabiopsiaproovide hindamise teel, kus parasiit leitakse.
Tsütoloogia
Giemsa värvimist kasutatakse ka endotservikaalsete proovide tsütoloogiliseks uurimiseks, kuigi see pole selleks otstarbeks kõige laialdasemalt kasutatav tehnika.
Ressursside nappuse korral saab seda siiski kasutada, pakkudes sarnast funktsionaalsust kui PAP-test ja madalama hinnaga. See aga nõuab uurijalt eriteadmisi.
Tsütogeneetika
Giemsa värvimise põhiomaduseks on võime tugevalt seonduda adeniini ja tümiini poolest rikaste DNA piirkondadega. See võimaldab DNA-d visualiseerida raku mitoosi ajal erinevates kondensatsiooniastmetes.
Need uuringud on vajalikud kromaatiliste aberratsioonide, näiteks kromosoomide eri piirkondade dubleerimise, deletsiooni või translokatsiooni tuvastamiseks.
Giemsa värvimise efektiivsust näitavad uuringud
Cannova jt (2016) võrdlesid kolme värvimistehnikat naha leishmaniaasi diagnoosimiseks.
Selleks kasutati katseloomalt saadud proove ( Mesocristus auratus) eksperimentaalselt nakatatud Leishmanias'ega.
Autorid näitasid, et Giemsa värvimine oli Pap-mart® ja Gaffney värvimisest parem. Seetõttu pidasid nad Giemsa värvimist ideaalseks naha leišmaniaasi diagnoosimiseks.
Autorite suurepärased tulemused tulenevad asjaolust, et Giemsa segu moodustavate värvainete kombinatsioonil on vajalikud tingimused soodsa kontrasti loomiseks, mis võimaldab amastigootide struktuure selgelt eristada nii rakusiseselt kui ka rakuväliselt.
Teised meetodid (Pap-mart® ja Gaffney) tegid seda samuti, kuid nõrgemal viisil ja seetõttu raskemini visualiseeritavad. Seetõttu on leishmaniaasi parasitoloogiliseks diagnoosimiseks soovitatav Giemsa värvimine.
Samamoodi hindasid Ramírez jt (1994) uuringus Giemsa ja Lendrumi värvingute kehtivust konjunktiivi määrdumisel selliste haiguste tuvastamiseks nagu Chlamydia trachomatis.
Autorid leidsid, et Giemsa ja Ledrum'i värvidel on sama spetsiifilisus, kuid Giemsa osutus tundlikumaks.
See selgitab, miks Giemsa värvimist kasutatakse praegu kõige sagedamini klamüüdiainfektsioonide diagnoosimiseks, eriti piiratud ressursside korral.
Soovitused hea värvimise kohta
Lehti ei tohiks liiga kiiresti kuivatada. Peaksite ootama sobiva aja, et need õhu käes kuivaksid. Umbes 2 tundi.
Parima tulemuse saavutamiseks värvi kohe 2 tunni pärast.
Selleks, et plekid paremini tahkuksid ja seguneksid, tuleks proov lehele laiali jaotada õhukese ühtlase kihina.
Eelistatud vereproov on kapillaarne, kuna määrd võetakse otse veretilgast ja seetõttu ei sisalda proov lisaaineid, mis soodustab rakustruktuuride säilimist.
Kui aga kasutatakse venoosset verd, tuleks antikoagulandina kasutada EDTA-d, mitte hepariini, kuna viimane tavaliselt deformeerib rakke.
Giemsa värvimise tavalised vead
Selle värvimistehnika kasutamisel võib teha vigu. Nendest annavad tunnistust konstruktsiooni värvitooni järsk muutus.
Äärmiselt sinine värvus
See võib olla tingitud:
- Väga paksud plekid
- Värvimisaja ületamine
- Pese ebapiisavalt.
- Neutraalsest (aluselisest) pH-st tunduvalt kõrgemate reagentide kasutamine.
Nendes tingimustes moonutatakse järgmiste struktuuride värve, nii et erütrotsüüdid ei värvu lõheroosaks, vaid roheliseks, eosinofiilide graanulid, mis peaksid olema telliskivipunased, muutuvad sinakaks või halliks jne. Tavapärasest toonist kõrvalekalle.
Liiga roosa värvus
See võib olla tingitud:
- Ebapiisav värvimisaeg.
- Pikaajaline või liigne pesemine.
- Mitte eriti kuiv
- Väga happeliste reagentide kasutamine.
Sel konkreetsel juhul on tavaliselt siniseks toonitud struktuurid vaevu nähtavad, samas kui roosaks toonitud struktuuridel on väga liialdatud toonid.
Näide: Punased verelibled on erkpunased või tumeoranžid, tuumakromatiin on kahvaturoosa ja eosinofiilide graanulid värvuvad erkpunaseks.
Sademete olemasolu määrdumisproovis
Põhjused võivad olla:
- Kasutage määrdunud või halvasti pestud linasid.
- Ärge laske plekil hästi kuivada.
- Jätke kinnituslahus pikaks ajaks seisma.
- Ebaõige pesemine värvimise lõpus.
- Kasutatava värvaine ebapiisav filtreerimine või filtreerimise puudumine.
Morfoloogiliste artefaktide olemasolu
Plekkidel võivad ilmneda morfoloogilised artefaktid, mis raskendavad struktuuride visualiseerimist ja tõlgendamist. Selle põhjuseks on:
- Kasutatava antikoagulandi tüüp, näiteks hepariin.
- Määrdunud, kahjustatud või õliste lehtede kasutamine.
Salvestusrežiim
Pärast valmistamist tuleks värvainet hoida toatemperatuuril (15–25 °C), et vältida värvaine sadestumist. Seda tuleks säilitada tihedalt suletud merevaigukollases anumas.
Viited
- Cannova D, Brito E ja Simons M. Värvimistehnikate hindamine naha leishmaniaasi diagnoosimiseks. Tere . 2016; 20 (2): 24-29.
- PanReac Applichemi reaktiivid ITW. Giemsa värvimine. Versioon 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Hispaania.
- Clark G. Värvimisprotseduurid (1981), 4. osa. Williams ja Willkins.
- Rakenduslik kliiniline keemia. Giemsa värv diagnostikaks vitro Levitaja: cromakit.es
- Ramírez I, Mejía M, García de la Riva J, Hermes F ja Grazioso C. Giemsa ja Lendrumi värvingute kehtivus konjunktiivi määrdumisel haigustekitajate tuvastamiseks. Chlamydia trachomatis. Sanit Panami kauss. 1994; 116(3): 212-216.
- Casas-Rincón G. Üldine mükoloogia. 1994. 2. väljaanne. Venezuela keskülikool, raamatukogu väljaanded. Venezuela, Caracas
- "Giemsa värvimine." Vikipeedia, vaba entsüklopeedia . 1. september 2017, kell 01:02 UTC. 6. detsember 2018, et.wikipedia.org.