Giemsa bojenje je tehnika koja se koristi u mikrobiologiji i citogenetici za bojenje stanica i tkiva, omogućujući vizualizaciju specifičnih struktura. Razvio ju je Gustav Giemsa 1904. godine, a jedna je od najčešće korištenih tehnika u dijagnostičkim laboratorijima za identifikaciju mikroorganizama, parazita i kromosoma.
Giemsa bojenje zahtijeva materijale poput Giemsa boje, metanola i destilirane vode. Tehnika uključuje fiksiranje stanica na staklene pločice, nakon čega slijedi nanošenje Giemsa boje razrijeđene u metanolu. Nakon bojenja, stanice se isperu destiliranom vodom i promatraju pod mikroskopom.
Glavne upotrebe Giemsinog bojenja uključuju identifikaciju patogena poput Plasmodija (koji uzrokuje malariju), Tripanosome (koji uzrokuje Chagasovu bolest) i bakterija poput Chlamydia i Rickettsia. Nadalje, Giemsino bojenje se široko koristi u analizi kromosoma za dijagnosticiranje genetskih bolesti i identifikaciju kromosomskih abnormalnosti.
Korak-po-korak vodič za učinkovito izvođenje Giemsa bojenja.
Giemsa bojenje je bitna tehnika u kliničkim analizama i znanstveno-istraživačkim laboratorijima. Omogućuje vizualizaciju različitih staničnih struktura, poput kromosoma, parazita i bakterija, specifičnim bojenjem njihovih komponenti. U ovom ćemo članku korak po korak objasniti kako učinkovito izvesti Giemsa bojenje.
Korak 1: Pripremite Giemsa otopinu, koja se može kupiti gotova ili pripremljena od praha. Otopinu treba razrijediti u destiliranoj vodi u omjeru koji preporučuje proizvođač.
Korak 2: Uzorak pričvrstite na staklenu pločicu pomoću topline ili fiksativa, poput etilnog alkohola. Osigurajte da je uzorak sigurno pričvršćen kako biste izbjegli izobličenje tijekom bojenja.
Korak 3: Fiksirani uzorak prekrijte Giemsa otopinom, pazeći da je cijela površina ravnomjerno prekrivena. Ostavite predmetno stakalce u kontaktu s otopinom određeno vrijeme, obično između 10 i 30 minuta.
Korak 4: Isperite preparat pod mlazom vode kako biste uklonili višak boje. Nježno osušite preparat upijajućim papirom ili komprimiranim zrakom.
Korak 5: Obojeni uzorak promatrajte pod svjetlosnim mikroskopom koristeći odgovarajuće objektive za povećanje. Giemsa bojenje omogućit će vizualizaciju staničnih struktura s većom jasnoćom i kontrastom.
Giemsa bojenje se široko koristi u raznim područjima biologije i medicine, kao što su dijagnosticiranje parazitskih bolesti, analiza krvnih stanica i identifikacija zaraznih uzročnika. Ispravnim slijeđenjem gore opisanih koraka mogu se dobiti točni i pouzdani rezultati Giemsa bojenja.
Detaljno razumite Giemsa proces bojenja i kako on funkcionira.
Giemsa bojenje je metoda koja se široko koristi u mikrobiološkim i hematološkim laboratorijima za vizualizaciju staničnih struktura i otkrivanje patogena. Razvio ju je Gustav Giemsa 1902. godine, a temelji se na afinitetu bazičnih i kiselih boja za različite stanične komponente.
Materijali potrebni za Giemsa bojenje uključuju Giemsa boju, otopine za fiksaciju i odbojavanje, preparate, pokrovna stakalca i mikroskop. Giemsa boja je mješavina metilenskog plavog, eozina i glicerina i koristi se za bojenje nuklearnih i citoplazmatskih struktura stanica.
Giemsa tehnika bojenja uključuje fiksiranje stanica na pločicu, nakon čega slijedi nanošenje Giemsa boje tijekom određenog vremenskog razdoblja. Nakon bojenja, stanice se ispiru destiliranom vodom i obezboje kako bi se uklonio višak boje. Na kraju se pločice suše i promatraju pod mikroskopom.
Glavne upotrebe Giemsinog bojenja uključuju identifikaciju parazita koji se prenose krvlju, poput Plasmodium spp., i diferencijaciju krvnih stanica u razmazima periferne krvi. Nadalje, ova se metoda široko koristi u identifikaciji bakterija, virusa i drugih patogena u kliničkim uzorcima.
Njegovo djelovanje temelji se na afinitetu bazičnih i kiselih boja s različitim staničnim komponentama, pružajući jasne i detaljne slike pod mikroskopom.
Razumjeti postupak patološke anatomije s Giemsa bojenjem za kliničku analizu.
Giemsa bojenje je tehnika koja se koristi u anatomskoj patologiji za kliničku analizu uzoraka tkiva. Razvio ju je njemački znanstvenik Gustav Giemsa, a ova se boja široko koristi zbog svoje sposobnosti isticanja različitih staničnih komponenti, poput jezgri, kromosoma i parazita.
Giemsa bojenje zahtijeva niz materijala, uključujući Giemsa boju, metilirani alkohol, fiziološku otopinu i staklene pločice. Postupak uključuje fiksiranje uzorka u metiliranom alkoholu, nanošenje Giemsa boje i ispiranje fiziološkom otopinom. Nakon bojenja, uzorci se promatraju pod mikroskopom radi analize.
Giemsa bojenje se široko koristi u laboratorijima za anatomsku patologiju za identifikaciju različitih patologija, poput parazitskih infekcija, leukemije i autoimunih bolesti. Tehnika omogućuje detaljnu analizu staničnih struktura, olakšavajući kliničku dijagnozu i praćenje liječenja.
Njegova upotreba je neophodna za dijagnosticiranje i liječenje raznih bolesti, što ga čini nezamjenjivom tehnikom za zdravstvene djelatnike.
Identifikacija boje koja se koristi za bojenje krvnog razmaza.
Giemsa bojenje je uobičajena metoda koja se koristi za promatranje različitih vrsta krvnih stanica u krvnom razmazu. Glavna boja koja se koristi u ovom procesu je Giemsa boja, što je mješavina metilenskog plavog, eozina i azurnog B. Ova boja je posebno učinkovita u bojenju struktura kao što su stanične jezgre, kromosomi i citoplazmatske inkluzije.
Giemsa boja: podloga, materijali, tehnika i upotreba
O Giemsa boja je vrsta bojenja kliničkih uzoraka, temeljena na mješavini kiselih i bazičnih boja. Njegovo stvaranje inspirirano je radom Romanowskog, gdje ga je Gustav Giemsa, njemački kemičar i bakteriolog, usavršio dodavanjem glicerola za stabilizaciju spojeva.
Promjene napravljene u Romanowskyjevoj originalnoj tehnici omogućile su nam znatno poboljšanje mikroskopskih promatranja; stoga je tehnika nazvana Giemsa bojenje.
Budući da je to jednostavna, vrlo funkcionalna i ekonomična tehnika, trenutno se široko koristi u kliničkom laboratoriju za hematološke razmaze, uzorke koštane srži i presjeke tkiva.
Giemsa tehnika bojenja vrlo je korisna za citološke studije jer omogućuje promatranje specifičnih staničnih struktura. Ova tehnika boji citoplazme, jezgre, nukleole, vakuole i granule stanica, omogućujući razlikovanje finih tragova kromatina.
Nadalje, mogu se otkriti značajne promjene u veličini, obliku ili boji jezgre, gdje je moguće vizualizirati gubitak odnosa jezgra-citoplazma.
S druge strane, omogućuje identifikaciju nezrelih stanica u koštanoj srži i perifernoj krvi, što je važno za dijagnozu ozbiljnih bolesti poput leukemije. Također omogućuje detekciju hemoparazita, izvanstaničnih i unutarstaničnih bakterija, gljivica i drugih patogena.
U citogenetici se široko koristi jer je moguće proučavati mitozu stanica.
Giemsa podloga za mrlje
Boje Romanowskyjevog tipa koriste kontrast između kiselih i bazičnih boja za bojenje bazičnih, odnosno kiselih struktura. Kao što se može vidjeti, kisele boje imaju afinitet za bojenje bazičnih struktura i obrnuto.
Osnovna boja koja se koristi je metilensko plavo i njegovi oksidirani derivati (Azure A i Azure B), dok je kisela boja eozin.
Kisele strukture stanica su nukleinske kiseline, segmentirane bazofilne granule, između ostalog, pa se boje metilenskim plavilom.
U istom smislu, osnovne strukture stanica su hemoglobin i neke granule, poput onih sadržanih u segmentiranim eozinofilima, između ostalog; one će biti obojene eozinom.
S druge strane, budući da su metilensko plavo i nebesko plavo okarakterizirane kao metakromatske boje, one mogu pružiti varijabilan ton različitim strukturama ovisno o polianionskom naboju koji posjeduju.
Na taj način strateška kombinacija bazičnih i kiselih boja može razviti širok spektar boja, prema biokemijskim karakteristikama svake strukture, u rasponu od nijansi blijedoplave, tamnoplave, lila i ljubičaste u slučaju kiselih struktura.
Iako je boja koju daje eozin stabilnija, on stvara boje između crvenkasto-narančaste i losos boje.
Materijali
Materijali za pripremu osnovne otopine
Priprema osnovne otopine zahtijeva vaganje 600 mg Giemsa boje u prahu, mjerenje 500 ml metilnog alkohola bez acetona i 50 ml neutralnog glicerina.
Metoda pripreme osnovne otopine
Izvagani Giemsa prah stavite u mužar. Ako postoje grudice, treba ih usitniti. Zatim dodajte znatnu količinu izmjerenog glicerina i dobro promiješajte. Dobivenu smjesu ulijte u vrlo čistu jantarnu bocu.
Preostali glicerin se dodaje u mort. Ponovno promiješajte kako biste uklonili preostalu boju koja se zalijepila za stijenke morta, a zatim ga ulijte u istu bocu.
Boca se pokrije i transportira 2 sata u vodenoj kupelji na 55 °C. Dok je u vodenoj kupelji, smjesu lagano promiješajte svakih pola sata.
Smjesa se zatim ostavi da se ohladi prije dodavanja alkohola. Dio izmjerenog alkohola prvo se dodaje u mort kako bi se dovršilo ispiranje preostale boje, a zatim se dodaje smjesi zajedno s preostalim alkoholom.
Ovaj pripravak treba ostaviti da sazrijeva najmanje 2 tjedna. Dio koji se koristi u matičnoj tekućini treba filtrirati.
Kako bi se izbjegla kontaminacija pripravka, preporučuje se prebaciti dio koji će se stalno koristiti u malu jantarnu bočicu s kapaljkom. Napunite svaki put kada se reagens potroši.
Materijali za pripremu puferske otopine
S druge strane, puferska otopina pri pH 7,2 priprema se na sljedeći način:
6,77 g natrijevog fosfata (bezvodnog) (izvagano NaHPO 4 ), 2,59 g kalijevog dihidrogenfosfata (KH 2 PO 4 ) i destilirana voda do 1000 ml.
Završna priprema boje
Za pripremu konačne otopine za bojenje, izmjerite 2 ml filtrirane osnovne otopine i pomiješajte je sa 6 ml puferske otopine. Smjesa se protrese.
Jedna relevantna činjenica koju treba uzeti u obzir jest da se tehnike pripreme bojila mogu razlikovati ovisno o komercijalnoj instalaciji.
Dodatni materijali potrebni za izradu bojanke
Uz opisane materijale, moraju postojati obojeni mostovi, majice s vodom ili tampon za pranje odjeće, plahte s predmetima ili navlakama, timer za kontrolu vremena bojanja i upijajući papir ili neki materijal koji služi za sušenje (gaza ili vata).
tehnika
Proces bojanja
1) Prije bojenja, uzorak se mora rasporediti po čistom predmetnom pločici.
Uzorci mogu biti krv, koštana srž, histološki presjeci tkiva ili cervikalno-vaginalni uzorci. Preporučuje se da paste budu tanke i da se suše 1 do 2 sata prije bojenja.
2) Na mostu za bojanje postavljaju se svi listovi u boji. Uvijek se radi istim redoslijedom, a svaki list je jasno označen.
3) Na razmaz stavite nekoliko kapi 100%-tnog metilnog alkohola (metanola) i ostavite 3 do 5 minuta da se uzorak fiksira i dehidrira.
4) Odbacite metanol prisutan na listu i ostavite ga da se osuši na zraku.
5) Nakon što se osuši, kapaljkom dodajte završnu otopinu za bojenje dok ne prekrijete cijeli list. Ostavite da djeluje 15 minuta. Neki autori preporučuju do 25 minuta. Ovisi o trgovini.
6) Ocijedite mrlju i isperite razmaz destiliranom vodom ili puferskom otopinom u 7.2.
7) Na upijajućem papiru ostavite listove da se osuše na zraku, poredani okomito uz pomoć potpore.
8) Obrišite stražnju stranu pločice gazom ili vatom umočenom u alkohol kako biste uklonili svu boju.
komunalije
Giemsa tehnika bojenja koristi se u nekoliko područja, uključujući: hematologiju, mikologiju, bakteriologiju, parazitologiju, citologiju i citogenetiku.
Hematologija
Ovo je najčešća upotreba ove boje. Njome se može identificirati svaka stanica prisutna u uzorcima koštane srži ili periferne krvi. Osim procjene broja stanica u svakoj seriji, može otkriti leukocitozu ili leukopeniju, trombocitopeniju itd.
Budući da je osjetljiv na identifikaciju nezrelih stanica, koristan je u dijagnosticiranju akutne ili kronične leukemije. Također može dijagnosticirati anemije poput anemije srpastih stanica, između ostalog.
Mikologija
U ovom području uobičajeno je koristiti Histoplasma capsulatum (intracelularna dimorfna gljiva) u uzorcima tkiva.
Bakteriologija
U hematološkim razmazima obojenim Giemsom moguće je otkriti Borrelije kod pacijenata s bolešću koja se naziva povratna groznica. Spirohete se obilno opažaju među eritrocitima u uzorcima prikupljenim na vrhuncu groznice.
Također je moguće vizualizirati unutarstanične bakterije kao Rickettsia sp. e Chlamydia trachomatis u zaraženim stanicama.
Parazitologija
U području parazitologije, Giemsa bojenje omogućilo je dijagnozu parazitskih bolesti poput malarije, Chagasove bolesti i lišmanijaze.
Kod prva dva parazita, Plasmodium sp e Trypanosoma cruzi, odnosno, mogu se vidjeti u perifernoj krvi zaraženih pacijenata i mogu se naći u različitim fazama ovisno o stadiju bolesti.
Za poboljšanje pretraživanja parazita u krvi preporučuje se korištenje Giemsa boje pomiješane s May-Grünwaldovom bojom.
Slično tome, kožna lišmanijaza može se dijagnosticirati procjenom uzoraka biopsije kože obojenih Giemsom na mjestima gdje se parazit nalazi.
Citologia
Giemsa bojenje se također koristi za citološku studiju endocervikalnih uzoraka, iako nije najčešće korištena tehnika za tu svrhu.
Međutim, u slučajevima nedostatka resursa, može se koristiti, nudeći sličnu funkcionalnost kao i Papa test, a uz nižu cijenu. Međutim, zahtijeva stručnost ispitivača.
Citogenetika
Ključna značajka Giemsa bojenja je njegova sposobnost snažnog vezanja za regije DNA bogate adeninom i timinom. To omogućuje vizualizaciju DNA tijekom stanične mitoze, u različitim stanjima kondenzacije.
Ove studije su potrebne za otkrivanje kromatskih aberacija, poput duplikacija, delecija ili translokacija različitih regija kromosoma.
Istraživanje koje pokazuje učinkovitost Giemsa bojenja
Cannova i sur. (2016.) usporedili su tri tehnike bojenja za dijagnozu kožne lišmanijaze.
U tu svrhu korišteni su uzorci dobiveni od pokusne životinje ( Mesocrisetus auratus) eksperimentalno inokulirani lišmanijama.
Autori su pokazali da je Giemsa bojenje superiornije u odnosu na Pap-mart® i Gaffney bojenje. Stoga su smatrali da je Giemsa bojenje idealno za dijagnosticiranje kožne lišmanijaze.
Izvrsni rezultati koje su autori postigli posljedica su činjenice da kombinacija boja koje čine Giemsinu smjesu ima potrebne uvjete za stvaranje povoljnog kontrasta, što omogućuje jasno razlikovanje struktura amastigota, kako intra- tako i ekstracelularno.
Druge tehnike (Pap-mart® i Gaffney) također su to učinile, ali na slabiji način i stoga teže za vizualizaciju. Zato se Giemsa bojenje preporučuje za parazitološku dijagnozu lišmanijaze.
Slično tome, studija Ramíreza i suradnika (1994.) procijenila je valjanost Giemsa i Lendrum bojenja u konjunktivalnim razmazima za identifikaciju Klamidija trahomatis.
Autori su utvrdili da Giemsa i Ledrum boje imaju istu specifičnost, ali se Giemsa pokazala osjetljivijom.
To objašnjava zašto se Giemsa bojenje trenutno najčešće koristi za dijagnozu klamidijske infekcije, posebno u zemljama s ograničenim resursima.
Preporuke za dobro bojanje
Listove ne treba sušiti prebrzo. Trebali biste pričekati odgovarajuće vrijeme da se osuše na zraku. Otprilike 2 sata.
Za najbolje rezultate obojite odmah nakon 2 sata.
Da bi se mrlje bolje stvrdnule i izblendale, uzorak treba nanijeti tankim, ravnomjernim slojem po plahti.
Poželjni uzorak krvi je kapilarni, jer se razmaz uzima izravno iz kapi krvi i stoga uzorak ne sadrži nikakve dodatke, što pogoduje održavanju staničnih struktura.
Međutim, ako se koristi venska krv, kao antikoagulant treba koristiti EDTA, a ne heparin, budući da potonji obično deformira stanice.
Uobičajene pogreške kod Giemsa bojenja
Prilikom korištenja ove tehnike bojanja mogu se napraviti pogreške. To se očituje u naglim promjenama nijanse strukture.
Izrazito plava obojenost
Može biti zbog:
- Vrlo debele mrlje
- Prekoračenje vremena bojenja
- Nedovoljno perite.
- Upotreba reagensa znatno iznad neutralnog (alkalnog) pH.
U tim uvjetima, boje sljedećih struktura su iskrivljene, tako da će eritrociti, umjesto da oboje losos ružičasto, postati zeleni, eozinofilne granule, koje bi trebale biti obojene ciglastocrveno, postat će plavkaste ili sive i tako dalje. odstupanje od uobičajenih nijansi.
Previše ružičasta obojenost
Može biti zbog:
- Nedovoljno vrijeme bojenja.
- Dugotrajno ili pretjerano pranje.
- Nije baš suho
- Upotreba vrlo kiselih reagensa.
U ovom konkretnom slučaju, strukture koje su inače obojene plavom bojom bit će jedva vidljive, dok će strukture koje su obojene ružičastom bojom imati vrlo pretjerane nijanse.
Primjer: Crvene krvne stanice će izgledati jarko crvene ili tamno narančaste, nuklearni kromatin će izgledati blijedoružičasto, a eozinofilne granule će se obojiti jarko crveno.
Prisutnost precipitata u razmazu
Uzroci mogu biti:
- Koristite prljave ili loše oprane plahte.
- Ne dopustite da se mrlja dobro osuši.
- Ostavite otopinu za fiksiranje dugo vremena.
- Nepravilno pranje na kraju bojenja.
- Nedovoljna filtracija ili nikakva filtracija korištene boje.
Prisutnost morfoloških artefakata
Morfološki artefakti mogu se pojaviti u mrljama, što otežava vizualizaciju i interpretaciju struktura. To je zato što:
- Vrsta korištenog antikoagulansa, poput heparina.
- Korištenje prljavog, oštećenog ili masnog lišća.
Način pohrane
Nakon pripreme, boju treba čuvati na sobnoj temperaturi (15-25°C) kako bi se spriječilo taloženje boje. Treba je čuvati u dobro zatvorenoj jantarnoj posudi.
Reference
- Cannova D, Brito E i Simons M. Evaluacija tehnika bojenja za dijagnozu kožne lišmanijaze. zdravo . 2016.; 20 (2): 24-29.
- PanReac Applichem reagensi ITW. Bojenje po Giemsi. Verzija 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Španjolska.
- Clark G. Postupci bojenja (1981.), 4. Williams & Willkins.
- Primijenjena klinička kemija. Giemsa boja za dijagnostiku vitro Distributer: cromakit.es
- Ramírez I, Mejía M, García de la Riva J, Hermes F i Grazioso C. Valjanost Giemsa i Lendrum boja u konjunktivalnim razmazima za identifikaciju Klamidija trahomatis. Zdjela Sanit Panam. 1994 .; 116 (3): 212-216.
- Casas-Rincón G. Opća mikologija. 1994. 2. izdanje. Središnje sveučilište Venezuele, knjižnična izdanja. Venezuela, Caracas
- "Giemsa bojenje." Wikipedija, slobodna enciklopedija 1. rujna 2017. u 01:02 UTC. 6. prosinca 2018., hr.wikipedia.org.