La colorazione di Giemsa è una tecnica utilizzata in microbiologia e citogenetica per colorare cellule e tessuti, consentendo la visualizzazione di strutture specifiche. Sviluppata da Gustav Giemsa nel 1904, la colorazione di Giemsa è una delle tecniche più utilizzate nei laboratori diagnostici per identificare microrganismi, parassiti e cromosomi.
La colorazione di Giemsa richiede materiali come il colorante di Giemsa, metanolo e acqua distillata. La tecnica prevede il fissaggio delle cellule su vetrini, seguito dall'applicazione del colorante di Giemsa diluito in metanolo. Dopo la colorazione, le cellule vengono lavate in acqua distillata e osservate al microscopio.
I principali utilizzi della colorazione di Giemsa includono l'identificazione di agenti patogeni come il Plasmodium (che causa la malaria), il Trypanosoma (che causa la malattia di Chagas) e batteri come la Clamidia e la Rickettsia. Inoltre, la colorazione di Giemsa è ampiamente utilizzata nell'analisi cromosomica per diagnosticare malattie genetiche e identificare anomalie cromosomiche.
Guida passo passo per eseguire in modo efficace la colorazione Giemsa.
La colorazione di Giemsa è una tecnica essenziale nei laboratori di analisi clinica e di ricerca scientifica. Permette la visualizzazione di varie strutture cellulari, come cromosomi, parassiti e batteri, attraverso la colorazione specifica dei loro componenti. In questo articolo, spiegheremo passo dopo passo come eseguire la colorazione di Giemsa in modo efficace.
Passo 1: Preparare una soluzione di Giemsa, che può essere acquistata già pronta o preparata in polvere. La soluzione deve essere diluita in acqua distillata secondo le proporzioni raccomandate dal produttore.
Passo 2: Fissare il campione su un vetrino utilizzando calore o fissativi, come l'alcol etilico. Assicurarsi che il campione sia fissato saldamente per evitare distorsioni durante la colorazione.
Passo 3: Coprire il campione fissato con la soluzione di Giemsa, assicurandosi che l'intera superficie sia uniformemente ricoperta. Lasciare il vetrino a contatto con la soluzione per un periodo di tempo specifico, solitamente compreso tra 10 e 30 minuti.
Passo 4: Sciacquare il vetrino sotto l'acqua corrente per rimuovere la macchia in eccesso. Asciugare delicatamente il vetrino con carta assorbente o aria compressa.
Passo 5: Osservare il campione colorato al microscopio ottico utilizzando obiettivi di ingrandimento appropriati. La colorazione di Giemsa consentirà la visualizzazione delle strutture cellulari con maggiore chiarezza e contrasto.
La colorazione di Giemsa è ampiamente utilizzata in vari campi della biologia e della medicina, come la diagnosi di malattie parassitarie, l'analisi delle cellule del sangue e l'identificazione di agenti infettivi. Seguendo correttamente i passaggi sopra descritti, è possibile ottenere risultati accurati e affidabili.
Scopri nel dettaglio il processo di colorazione Giemsa e come funziona.
La colorazione di Giemsa è un metodo ampiamente utilizzato nei laboratori di microbiologia ed ematologia per visualizzare le strutture cellulari e rilevare i patogeni. Sviluppato da Gustav Giemsa nel 1902, questo metodo si basa sull'affinità dei coloranti basici e acidi per le diverse componenti cellulari.
I materiali necessari per la colorazione di Giemsa includono la colorazione di Giemsa, soluzioni di fissazione e decolorazione, vetrini, coprioggetto e un microscopio. La colorazione di Giemsa è una miscela di blu di metilene, eosina e glicerina e viene utilizzata per colorare le strutture nucleari e citoplasmatiche delle cellule.
La tecnica di colorazione Giemsa prevede il fissaggio delle cellule su un vetrino, seguito dall'applicazione del colorante Giemsa per un periodo di tempo specificato. Dopo la colorazione, le cellule vengono lavate con acqua distillata e decolorate per rimuovere il colorante in eccesso. Infine, i vetrini vengono asciugati e osservati al microscopio.
Gli usi principali della colorazione di Giemsa includono l'identificazione di parassiti ematici, come Plasmodium spp., e la differenziazione delle cellule del sangue negli strisci di sangue periferico. Inoltre, questo metodo è ampiamente utilizzato per l'identificazione di batteri, virus e altri agenti patogeni in campioni clinici.
Il suo funzionamento si basa sull'affinità dei coloranti basici e acidi con i diversi componenti cellulari, fornendo immagini chiare e dettagliate al microscopio.
Comprendere la procedura di anatomia patologica con colorazione di Giemsa per l'analisi clinica.
La colorazione di Giemsa è una tecnica utilizzata in anatomopatologia per l'analisi clinica di campioni di tessuto. Sviluppata dallo scienziato tedesco Gustav Giemsa, questa colorazione è ampiamente utilizzata per la sua capacità di evidenziare vari componenti cellulari, come nuclei, cromosomi e parassiti.
La colorazione di Giemsa richiede diversi materiali, tra cui la colorazione di Giemsa, l'alcool denaturato, la soluzione salina e i vetrini portaoggetti. La procedura prevede il fissaggio del campione in alcool denaturato, l'applicazione della colorazione di Giemsa e il lavaggio con soluzione salina. Dopo la colorazione, i campioni vengono osservati al microscopio per l'analisi.
La colorazione di Giemsa è ampiamente utilizzata nei laboratori di anatomia patologica per identificare diverse patologie, come infezioni parassitarie, leucemie e malattie autoimmuni. La tecnica consente un'analisi dettagliata delle strutture cellulari, facilitando la diagnosi clinica e il monitoraggio del trattamento.
Il suo utilizzo è essenziale per la diagnosi e il trattamento di diverse patologie, rendendola una tecnica indispensabile per gli operatori sanitari.
Identificazione del colorante utilizzato per colorare uno striscio di sangue.
La colorazione di Giemsa è un metodo comune utilizzato per osservare diversi tipi di cellule del sangue in uno striscio di sangue. Il colorante principale utilizzato in questo processo è macchia di Giemsa, che è una miscela di blu di metilene, eosina e azzurro B. Questo colorante è particolarmente efficace nella colorazione di strutture quali nuclei cellulari, cromosomi e inclusioni citoplasmatiche.
Tinta Giemsa: base, materiali, tecnica e utilizzi
O macchia di Giemsa è un tipo di colorazione per campioni clinici, basata su una miscela di coloranti acidi e basici. La sua creazione trasse ispirazione dal lavoro di Romanowsky, dove Gustav Giemsa, chimico e batteriologo tedesco, la perfezionò aggiungendo glicerolo per stabilizzare i composti.
Le modifiche apportate alla tecnica originale di Romanowsky permisero di migliorare notevolmente le osservazioni microscopiche; per questo motivo, la tecnica fu chiamata colorazione di Giemsa.
Poiché si tratta di una tecnica semplice, altamente funzionale ed economica, è attualmente ampiamente utilizzata nei laboratori clinici per strisci ematologici, campioni di midollo osseo e sezioni di tessuto.
La tecnica di colorazione di Giemsa è molto utile per gli studi citologici, poiché consente l'osservazione di specifiche strutture cellulari. Questa tecnica colora citoplasmi, nuclei, nucleoli, vacuoli e granuli delle cellule, riuscendo a distinguere anche piccole tracce di cromatina.
Inoltre, è possibile rilevare cambiamenti significativi nelle dimensioni, nella forma o nel colore del nucleo, dove è possibile visualizzare la perdita della relazione nucleo-citoplasma.
D'altra parte, consente l'identificazione di cellule immature nel midollo osseo e nel sangue periferico, importante per la diagnosi di malattie gravi come la leucemia. Permette inoltre di rilevare emoparassiti, batteri extracellulari e intracellulari, funghi e altri agenti patogeni.
In citogenetica è ampiamente utilizzato, poiché consente di studiare la mitosi cellulare.
Fondotinta colorante Giemsa
Le colorazioni di tipo Romanowsky sfruttano il contrasto tra coloranti acidi e basici per colorare rispettivamente strutture basiche e acide. Come si può osservare, i coloranti acidi hanno un'affinità per la colorazione di strutture basiche e viceversa.
Il colorante basico utilizzato è il blu di metilene e i suoi derivati ossidati (azzurro A e azzurro B), mentre il colorante acido è l'eosina.
Le strutture acide delle cellule sono, tra gli altri, acidi nucleici e granuli basofili segmentati, per cui vengono colorate con blu di metilene.
Nello stesso senso, le strutture fondamentali delle cellule sono l'emoglobina e alcuni granuli, come quelli contenuti negli eosinofili segmentati, tra gli altri; questi saranno colorati con eosina.
D'altro canto, poiché il blu di metilene e l'azzurro cielo sono caratterizzati come coloranti metacromatici, possono conferire una tonalità variabile a diverse strutture a seconda della carica polianionica che possiedono.
In questo modo la combinazione strategica di coloranti basici e acidi può sviluppare un ampio spettro di colori, in base alle caratteristiche biochimiche di ciascuna struttura, che vanno dalle tonalità del blu pallido, del blu scuro, del lilla e del viola nel caso delle strutture acide.
Sebbene il colore fornito dall'eosina sia più stabile, genera colori tra l'arancione rossastro e il salmone.
Materiale
Materiali per la preparazione della soluzione madre
Per preparare la soluzione madre è necessario pesare 600 mg di colorante in polvere di Giemsa, misurare 500 ml di alcol metilico senza acetone e 50 ml di glicerina neutra.
Metodo di preparazione della soluzione madre
Versare la polvere di Giemsa pesata in un mortaio. Se ci sono grumi, polverizzarli. Quindi, aggiungere una quantità considerevole di glicerina misurata e mescolare accuratamente. Versare la miscela risultante in una bottiglia ambrata molto pulita.
Aggiungere la glicerina rimanente alla malta. Mescolare nuovamente per rimuovere eventuali residui di colorante rimasti attaccati alle pareti della malta, quindi versare il tutto nella stessa bottiglia.
La bottiglia viene coperta e trasportata per 2 ore in un bagno d'acqua a 55 °C. Mentre si trova nel bagno d'acqua, mescolare leggermente la miscela ogni mezz'ora.
La miscela viene quindi lasciata raffreddare prima di aggiungere l'alcol. Una parte dell'alcol misurato viene prima aggiunta alla malta per completare la rimozione di eventuali residui di colorante, quindi aggiunta alla miscela insieme all'alcol rimanente.
Questa preparazione deve essere lasciata maturare per almeno 2 settimane. La parte utilizzata nel liquore madre deve essere filtrata.
Per evitare la contaminazione del preparato, si consiglia di trasferire la porzione che verrà utilizzata costantemente in un piccolo flacone ambrato con contagocce. Rabboccare ogni volta che il reagente si esaurisce.
Materiali per la preparazione della soluzione tampone
D'altra parte, una soluzione tampone a pH 7,2 viene preparata come segue:
6,77 g di fosfato di sodio (anidro) (pesato NaHPO 4 ), 2,59 g di fosfato monobasico di potassio (KH 2 PO 4 ), e acqua distillata fino a 1000 ml.
Preparazione finale della tintura
Per preparare la soluzione colorante finale, misurare 2 ml della soluzione madre filtrata e mescolarla con 6 ml della soluzione tampone. La miscela viene agitata.
Un fatto rilevante da tenere in considerazione è che le tecniche di preparazione dei coloranti possono variare a seconda dell'installazione commerciale.
Materiali aggiuntivi necessari per realizzare la colorazione
Oltre ai materiali descritti, devono esserci dei ponti colorati, delle magliette con acqua o un tampone per lavare i vestiti, delle lenzuola con oggetti o coperte, un timer per controllare il tempo di colorazione e della carta assorbente o qualche materiale che serva per asciugare (garza o cotone).
Tecnica
Processo di colorazione
1) Prima della colorazione, il campione deve essere distribuito su un vetrino pulito.
I campioni possono essere sangue, midollo osseo, sezioni di tessuto istologico o campioni cervico-vaginali. Si raccomanda di utilizzare paste sottili e di lasciarle asciugare per 1-2 ore prima della colorazione.
2) Su un ponte da colorare, vengono posizionate tutte le foglie colorate. Si procede sempre nello stesso ordine e ogni foglia è chiaramente etichettata.
3) Mettere alcune gocce di alcol metilico (metanolo) al 100% sullo striscio e lasciare agire per 3-5 minuti per fissare e disidratare il campione.
4) Eliminare il metanolo presente sulla foglia e lasciarla asciugare all'aria.
5) Una volta asciutta, aggiungere la soluzione colorante finale con un contagocce fino a coprire l'intera foglia. Lasciare agire per 15 minuti. Alcuni autori consigliano fino a 25 minuti. Dipende dal negozio.
6) Scolare la macchia e lavare lo striscio con acqua distillata o con una soluzione tampone in 7.2.
7) Lasciate asciugare all'aria le foglie su carta assorbente, disponendole verticalmente con l'aiuto di un supporto.
8) Pulire il retro del vetrino con una garza o un batuffolo di cotone imbevuto di alcol per rimuovere eventuali tracce di colorante.
Utilità
La tecnica di colorazione di Giemsa viene utilizzata in diversi ambiti, tra cui: ematologia, micologia, batteriologia, parassitologia, citologia e citogenetica.
Ematologia
Questo è l'uso più comune per questa colorazione. Con essa, è possibile identificare ogni singola cellula presente nel midollo osseo o nei campioni di sangue periferico. Oltre a stimare il numero di cellule in ogni serie, può rilevare leucocitosi o leucopenia, trombocitopenia, ecc.
Grazie alla sua sensibilità nell'identificare le cellule immature, è utile nella diagnosi di leucemia acuta o cronica. Può anche diagnosticare anemie come l'anemia falciforme, tra le altre.
Micologia
In questa zona è comune usare Capsulatum Histoplasma (fungo dimorfico intracellulare) nei campioni di tessuto.
Batteriologia
Negli strisci ematologici colorati con Giemsa è possibile rilevare Borrelia sp. nei pazienti affetti da una malattia chiamata febbre ricorrente. Le spirochete sono state osservate in abbondanza tra gli eritrociti nei campioni raccolti al culmine della febbre.
È anche possibile visualizzare i batteri intracellulari come Rickettsia sp e Chlamydia trachomatis nelle cellule infette.
Parassitologia
Nel campo della parassitologia, la colorazione di Giemsa ha permesso la diagnosi di malattie parassitarie come la malaria, la malattia di Chagas e la leishmaniosi.
Nei primi due parassiti, Plasmodium sp e Trypanosoma cruzi, rispettivamente, possono essere osservati nel sangue periferico dei pazienti infetti e possono essere riscontrati in vari stadi a seconda dello stadio della malattia.
Per migliorare la ricerca dei parassiti nel sangue, si consiglia di utilizzare la colorazione di Giemsa mescolata alla colorazione di May-Grünwald.
Allo stesso modo, la leishmaniosi cutanea può essere diagnosticata valutando campioni di biopsia cutanea colorati con Giemsa in cui è presente il parassita.
Citologia
La colorazione di Giemsa viene utilizzata anche per lo studio citologico dei campioni endocervicali, sebbene non sia la tecnica più diffusa a questo scopo.
Tuttavia, in caso di scarsità di risorse, può essere utilizzato, offrendo funzionalità simili al Pap test e a un costo inferiore. Richiede però la competenza dell'esaminatore.
Citogenetica
Una caratteristica fondamentale della colorazione di Giemsa è la sua capacità di legarsi saldamente alle regioni del DNA ricche di adenina e timina. Ciò consente di visualizzare il DNA durante la mitosi cellulare, in diversi stati di condensazione.
Questi studi sono necessari per rilevare aberrazioni cromatiche, come duplicazioni, delezioni o traslocazioni di diverse regioni dei cromosomi.
Ricerca che dimostra l'efficacia della colorazione Giemsa
Cannova et al (2016) hanno confrontato tre tecniche di colorazione per la diagnosi della leishmaniosi cutanea.
A tale scopo sono stati utilizzati campioni ottenuti da un animale da esperimento ( Mesocrisetus auratus) inoculati sperimentalmente con Leishmania.
Gli autori hanno dimostrato che la colorazione di Giemsa era superiore alla colorazione di Pap-Mart® e di Gaffney. Pertanto, hanno ritenuto la colorazione di Giemsa ideale per la diagnosi della leishmaniosi cutanea.
Gli ottimi risultati ottenuti dagli autori sono dovuti al fatto che la combinazione dei coloranti che compongono la miscela Giemsa possiede le condizioni necessarie per creare un contrasto favorevole, consentendo di distinguere chiaramente le strutture degli amastigoti, sia intracellularmente che extracellularmente.
Anche le altre tecniche (Pap-mart® e Gaffney) hanno ottenuto lo stesso risultato, ma in modo più debole e quindi più difficile da visualizzare. Per questo motivo, la colorazione di Giemsa è raccomandata per la diagnosi parassitologica della leishmaniosi.
Allo stesso modo, uno studio di Ramírez et al (1994) ha valutato la validità delle colorazioni di Giemsa e Lendrum negli strisci congiuntivali per l'identificazione di Clamidiatracomatis.
Gli autori hanno stabilito che le colorazioni di Giemsa e Ledrum hanno la stessa specificità, ma la colorazione di Giemsa si è dimostrata più sensibile.
Questo spiega perché la colorazione di Giemsa è attualmente la tecnica più utilizzata per la diagnosi delle infezioni da clamidia, soprattutto in contesti con scarse risorse.
Consigli per una buona colorazione
Le foglie non devono essere essiccate troppo velocemente. È consigliabile attendere il tempo necessario per farle asciugare all'aria. Circa 2 ore.
Per risultati ottimali, colorare subito dopo 2 ore.
Per far sì che le macchie si fissino e si mescolino meglio, il campione deve essere distribuito sul foglio in uno strato sottile e uniforme.
Il campione di sangue preferito è quello capillare, poiché lo striscio viene prelevato direttamente dalla goccia di sangue e, pertanto, il campione non contiene additivi, il che favorisce il mantenimento delle strutture cellulari.
Tuttavia, se si utilizza sangue venoso, come anticoagulante si dovrebbe usare l'EDTA e non l'eparina, poiché quest'ultima solitamente deforma le cellule.
Errori comuni nella colorazione Giemsa
Utilizzando questa tecnica di colorazione, si possono commettere degli errori, evidenziati da improvvisi cambiamenti di tonalità nella struttura.
Colorazione estremamente blu
Potrebbe essere dovuto a:
- Macchie molto spesse
- Superamento del tempo di colorazione
- Lavare in modo insufficiente.
- Utilizzo di reagenti con pH ben al di sopra del pH neutro (alcalino).
In queste condizioni, i colori delle seguenti strutture vengono distorti, così che gli eritrociti, invece di tingersi di rosa salmone, diventeranno verdi, i granuli eosinofili, che dovrebbero essere tinti di rosso mattone, diventeranno bluastri o grigi, e così via. deviazione dalle tonalità usuali.
Colorazione eccessivamente rosa
Potrebbe essere dovuto a:
- Tempo di colorazione insufficiente.
- Lavaggi prolungati o eccessivi.
- Non molto secco
- Utilizzo di reagenti molto acidi.
In questo caso specifico, le strutture che normalmente sono colorate di blu saranno appena visibili, mentre le strutture che sono colorate di rosa avranno tonalità molto esagerate.
Esempio: i globuli rossi appariranno di colore rosso vivo o arancione intenso, la cromatina nucleare apparirà rosa pallido e i granuli eosinofili saranno di colore rosso vivo.
Presenza di precipitati nello striscio
Le cause possono essere:
- Utilizzare lenzuola sporche o lavate male.
- Non lasciare asciugare bene la macchia.
- Lasciare agire la soluzione fissante a lungo.
- Lavaggio improprio al termine della colorazione.
- Filtrazione inadeguata o nessuna filtrazione del colorante utilizzato.
Presenza di artefatti morfologici
Nelle macchie possono comparire artefatti morfologici, rendendo difficile la visualizzazione e l'interpretazione delle strutture. Questo perché:
- Tipo di anticoagulante utilizzato, ad esempio l'eparina.
- Utilizzo di foglie sporche, danneggiate o oleose.
Modalità di archiviazione
Dopo la preparazione, il colorante deve essere conservato a temperatura ambiente (15-25 °C) per evitare la precipitazione. Deve essere conservato in un contenitore ambrato ben chiuso.
Riferimenti
- Cannova D, Brito E e Simons M. Valutazione delle tecniche di colorazione per la diagnosi della leishmaniosi cutanea. Salus . 2016; 20(2): 24-29.
- Reagenti PanReac Applichem ITW. Colorazione Giemsa. Versione 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Spagna.
- Clark G. Procedure di colorazione (1981), 4a edizione Williams & Willkins.
- Chimica clinica applicata. Colorazione di Giemsa per la diagnostica in vitro . Distributore: cromakit.es
- Ramírez I, Mejía M, García de la Riva J, Hermes F e Grazioso C. Validità delle colorazioni di Giemsa e Lendrum negli strisci congiuntivali per l'identificazione di Clamidiatracomatis. Ciotola Sanit Panam. 1994; 116(3): 212-216.
- Casas-Rincón G. Micologia generale. 1994. 2a ed. Università Centrale del Venezuela, Edizioni Biblioteca. Venezuela, Caracas
- «Colorazione di Giemsa.» Wikipedia, l'enciclopedia libera 1 settembre 2017, alle 01:02 UTC. 6 dicembre 2018, en.wikipedia.org.