Pewarnaan Giemsa ialah teknik yang digunakan dalam mikrobiologi dan sitogenetik untuk mengotorkan sel dan tisu, membolehkan visualisasi struktur tertentu. Dibangunkan oleh Gustav Giemsa pada tahun 1904, pewarnaan Giemsa adalah salah satu teknik yang paling banyak digunakan dalam makmal diagnostik untuk mengenal pasti mikroorganisma, parasit dan kromosom.
Pewarnaan Giemsa memerlukan bahan seperti pewarna Giemsa, metanol dan air suling. Teknik ini melibatkan penetapan sel pada slaid kaca, diikuti dengan penggunaan pewarna Giemsa yang dicairkan dalam metanol. Selepas pewarnaan, sel-sel dibasuh dalam air suling dan diperhatikan di bawah mikroskop.
Kegunaan utama pewarnaan Giemsa termasuk pengenalpastian patogen seperti Plasmodium (yang menyebabkan malaria), Trypanosoma (yang menyebabkan penyakit Chagas), dan bakteria seperti Chlamydia dan Rickettsia. Tambahan pula, pewarnaan Giemsa digunakan secara meluas dalam analisis kromosom untuk mendiagnosis penyakit genetik dan mengenal pasti keabnormalan kromosom.
Panduan langkah demi langkah untuk melakukan pewarnaan Giemsa dengan berkesan.
Pewarnaan Giemsa adalah teknik penting dalam analisis klinikal dan makmal penyelidikan saintifik. Ia membolehkan visualisasi pelbagai struktur selular, seperti kromosom, parasit, dan bakteria, melalui pewarnaan khusus komponennya. Dalam artikel ini, kami akan menerangkan langkah demi langkah cara melakukan pewarnaan Giemsa dengan berkesan.
Langkah 1: Sediakan penyelesaian Giemsa, yang boleh dibeli siap sedia atau disediakan daripada serbuk. Penyelesaian hendaklah dicairkan dalam air suling pada nisbah yang disyorkan pengeluar.
Langkah 2: Betulkan sampel pada slaid kaca menggunakan haba atau fiksatif, seperti etil alkohol. Pastikan sampel dipasang dengan selamat untuk mengelakkan herotan semasa pewarnaan.
Langkah 3: Tutup spesimen tetap dengan larutan Giemsa, pastikan seluruh permukaan ditutup dengan sama rata. Biarkan slaid bersentuhan dengan larutan untuk tempoh masa tertentu, biasanya antara 10 dan 30 minit.
Langkah 4: Bilas slaid di bawah air yang mengalir untuk menghilangkan kotoran yang berlebihan. Keringkan slaid perlahan-lahan dengan kertas penyerap atau udara termampat.
Langkah 5: Perhatikan sampel yang diwarnakan di bawah mikroskop cahaya menggunakan objektif pembesar yang sesuai. Pewarnaan Giemsa akan membolehkan visualisasi struktur selular dengan lebih jelas dan kontras.
Pewarnaan Giemsa digunakan secara meluas dalam pelbagai bidang biologi dan perubatan, seperti mendiagnosis penyakit parasit, menganalisis sel darah, dan mengenal pasti agen berjangkit. Dengan mengikut langkah yang diterangkan di atas dengan betul, hasil pewarnaan Giemsa yang tepat dan boleh dipercayai boleh diperolehi.
Fahami proses pewarnaan Giemsa dan cara ia berfungsi secara terperinci.
Pewarnaan Giemsa ialah kaedah yang digunakan secara meluas dalam makmal mikrobiologi dan hematologi untuk menggambarkan struktur selular dan mengesan patogen. Dibangunkan oleh Gustav Giemsa pada tahun 1902, kaedah ini berdasarkan pertalian pewarna asas dan berasid untuk komponen selular yang berbeza.
Bahan yang diperlukan untuk pewarnaan Giemsa termasuk pewarnaan Giemsa, larutan penetapan dan penahan, slaid, slip penutup dan mikroskop. Pewarna Giemsa ialah campuran metilena biru, eosin, dan gliserin dan digunakan untuk mengotorkan struktur nuklear dan sitoplasma sel.
Teknik pewarnaan Giemsa melibatkan penetapan sel pada slaid, diikuti dengan penggunaan pewarnaan Giemsa untuk tempoh masa tertentu. Selepas pewarnaan, sel-sel dibasuh dengan air suling dan dinyahwarna untuk menghilangkan kotoran yang berlebihan. Akhir sekali, slaid dikeringkan dan diperhatikan di bawah mikroskop.
Kegunaan utama pewarnaan Giemsa termasuk pengenalpastian parasit bawaan darah, seperti Plasmodium spp., dan pembezaan sel darah dalam smear darah periferi. Tambahan pula, kaedah ini digunakan secara meluas dalam mengenal pasti bakteria, virus, dan patogen lain dalam sampel klinikal.
Operasinya adalah berdasarkan pertalian pewarna asas dan berasid dengan komponen selular yang berbeza, memberikan imej yang jelas dan terperinci di bawah mikroskop.
Fahami prosedur anatomi patologi dengan pewarnaan Giemsa untuk analisis klinikal.
Pewarnaan Giemsa adalah teknik yang digunakan dalam patologi anatomi untuk analisis klinikal sampel tisu. Dibangunkan oleh saintis Jerman Gustav Giemsa, noda ini digunakan secara meluas kerana keupayaannya untuk menyerlahkan pelbagai komponen selular, seperti nukleus, kromosom dan parasit.
Pewarnaan Giemsa memerlukan beberapa bahan, termasuk pewarnaan Giemsa, semangat metilasi, larutan garam dan slaid kaca. Prosedur ini melibatkan penetapan sampel dalam semangat metilasi, menggunakan pewarna Giemsa, dan mencuci dengan larutan garam. Selepas pewarnaan, sampel diperhatikan di bawah mikroskop untuk dianalisis.
Pewarnaan Giemsa digunakan secara meluas dalam makmal patologi anatomi untuk mengenal pasti pelbagai patologi, seperti jangkitan parasit, leukemia, dan penyakit autoimun. Teknik ini membolehkan analisis terperinci struktur selular, memudahkan diagnosis klinikal dan pemantauan rawatan.
Penggunaannya adalah penting untuk diagnosis dan rawatan pelbagai penyakit, menjadikannya teknik yang sangat diperlukan untuk profesional penjagaan kesihatan.
Pengenalpastian pewarna yang digunakan untuk mengotorkan sapuan darah.
Pewarnaan giemsa adalah kaedah biasa yang digunakan untuk memerhati pelbagai jenis sel darah dalam smear darah. Pewarna utama yang digunakan dalam proses ini ialah Noda Giemsa, yang merupakan campuran metilena biru, eosin, dan biru B. Pewarna ini amat berkesan dalam pewarnaan struktur seperti nukleus sel, kromosom dan kemasukan sitoplasma.
Pewarna Giemsa: asas, bahan, teknik dan kegunaan
O Noda Giemsa ialah sejenis pewarnaan untuk sampel klinikal, berdasarkan campuran pewarna berasid dan asas. Penciptaannya diilhamkan oleh karya Romanowsky, di mana Gustav Giemsa, seorang ahli kimia dan bakteriologi Jerman, menyempurnakannya dengan menambahkan gliserol untuk menstabilkan sebatian.
Perubahan yang dibuat kepada teknik asal Romanowsky membolehkan kami meningkatkan pemerhatian mikroskopik dengan ketara; Oleh itu, teknik itu dinamakan pewarnaan Giemsa.
Kerana ia adalah teknik yang mudah, sangat berfungsi dan menjimatkan, ia kini digunakan secara meluas di makmal klinikal untuk smear hematologi, sampel sumsum tulang dan bahagian tisu.
Teknik pewarnaan Giemsa sangat berguna untuk kajian sitologi, kerana ia membolehkan pemerhatian struktur selular tertentu. Teknik ini mengotorkan sitoplasma, nukleus, nukleolus, vakuol dan butiran sel, dapat membezakan kesan halus kromatin.
Tambahan pula, perubahan ketara dalam saiz, bentuk atau warna nukleus boleh dikesan, di mana adalah mungkin untuk menggambarkan kehilangan hubungan nukleus-sitoplasma.
Sebaliknya, ia membolehkan pengecaman sel tidak matang dalam sumsum tulang dan darah periferi, yang penting untuk diagnosis penyakit serius seperti leukemia. Ia juga membolehkan pengesanan hemoparasit, bakteria ekstrasel dan intrasel, kulat, dan patogen lain.
Dalam sitogenetik, ia digunakan secara meluas, kerana mungkin untuk mengkaji mitosis sel.
Asas pewarna Giemsa
Pewarnaan jenis Romanowsky menggunakan kontras antara pewarna berasid dan asas untuk mengotorkan struktur asas dan berasid, masing-masing. Seperti yang dapat dilihat, pewarna berasid mempunyai pertalian untuk mengotorkan struktur asas dan sebaliknya.
Pewarna asas yang digunakan ialah metilena biru dan terbitan teroksidanya (Azure A dan Azure B), manakala pewarna berasid ialah eosin.
Struktur asid sel adalah asid nukleik, granul basofil tersegmentasi, antara lain, jadi ia diwarnai dengan metilena biru.
Dalam erti kata yang sama, struktur asas sel ialah hemoglobin dan beberapa butiran, seperti yang terkandung dalam eosinofil bersegmen, antara lain; Ini akan diwarnai dengan eosin.
Sebaliknya, oleh kerana metilena biru dan biru langit dicirikan sebagai pewarna metachromatic, ia boleh memberikan nada berubah-ubah kepada struktur yang berbeza mengikut cas polianion yang mereka miliki.
Beginilah cara gabungan strategik pewarna asas dan berasid boleh membangunkan spektrum warna yang luas, mengikut ciri biokimia setiap struktur, daripada warna biru pucat, biru tua, ungu dan ungu dalam kes struktur berasid.
Walaupun warna yang disediakan oleh eosin lebih stabil, ia menghasilkan warna antara oren kemerahan dan salmon.
Bahan
Bahan untuk menyediakan penyelesaian stok
Penyediaan larutan stok memerlukan seberat 600 mg pewarna serbuk Giemsa, berukuran 500 ml alkohol metil bebas aseton, dan 50 ml gliserin neutral.
Kaedah penyediaan penyelesaian stok
Masukkan serbuk Giemsa yang telah ditimbang ke dalam mortar. Jika ada ketulan, hendaklah ditumbuk. Kemudian, tambahkan sejumlah besar gliserin yang disukat dan kacau hingga sebati. Tuangkan campuran yang terhasil ke dalam botol ambar yang sangat bersih.
Baki gliserin ditambah kepada mortar. Gaul sekali lagi untuk mengeluarkan sisa pewarna yang melekat pada dinding mortar dan kemudian tuangkan ke dalam botol yang sama.
Botol ditutup dan diangkut selama 2 jam dalam tab mandi air pada suhu 55 ° C. Semasa di dalam tab mandi air, kacau campuran sedikit setiap setengah jam.
Campuran kemudian dibiarkan sejuk sebelum menambah alkohol. Sebahagian daripada alkohol yang disukat terlebih dahulu ditambah ke dalam mortar untuk menyelesaikan membasuh sebarang pewarna yang tinggal, kemudian ditambah ke dalam campuran bersama-sama dengan baki alkohol.
Penyediaan ini hendaklah dibiarkan matang selama sekurang-kurangnya 2 minggu. Bahagian yang digunakan dalam minuman keras ibu hendaklah ditapis.
Untuk mengelakkan pencemaran penyediaan, disyorkan untuk memindahkan bahagian yang akan digunakan secara berterusan ke botol ambar kecil dengan penitis. Isi semula setiap kali reagen habis.
Bahan untuk menyediakan larutan penimbal
Sebaliknya, larutan penimbal pada pH 7,2 disediakan seperti berikut:
6,77 g natrium fosfat (kontang) (ditimbang NaHPO 4 ), 2,59 g kalium dihidrogen fosfat (KH 2 PO 4 ), dan air suling sehingga 1000 ml.
Penyediaan pewarna akhir
Untuk menyediakan larutan pewarnaan akhir, ukur 2 ml larutan stok yang ditapis dan campurkan dengan 6 ml larutan penimbal. Campuran digoncang.
Satu fakta relevan yang mesti diambil kira ialah teknik penyediaan pewarna mungkin berubah bergantung pada pemasangan komersial.
Bahan tambahan yang diperlukan untuk membuat pewarna
Sebagai tambahan kepada bahan yang diterangkan, mesti ada jambatan berwarna, t-shirt dengan air atau tampon untuk mencuci pakaian, cadar dengan objek atau penutup, pemasa untuk mengawal masa mewarna dan mengelap kertas atau beberapa bahan yang berfungsi untuk mengeringkan (kain kasa atau kapas).
Teknik
Proses mewarna
1) Sebelum pewarnaan, sampel mesti disebarkan pada slaid bersih.
Sampel boleh berupa darah, sumsum tulang, bahagian tisu histologi, atau sampel serviks-faraj. Adalah disyorkan bahawa pes menjadi nipis dan dibiarkan kering selama 1 hingga 2 jam sebelum pewarnaan.
2) Di atas jambatan pewarna, semua daun berwarna diletakkan. Ia sentiasa berfungsi dalam susunan yang sama, dan setiap daun dilabelkan dengan jelas.
3) Letakkan beberapa titis 100% metil alkohol (metanol) pada smear dan biarkan selama 3 hingga 5 minit untuk menetapkan dan dehidrasi sampel.
4) Buang metanol yang terdapat pada daun dan biarkan ia kering di udara.
5) Setelah kering, masukkan larutan pewarna terakhir dengan penitis sehingga seluruh daun tertutup. Biarkan selama 15 minit. Sesetengah pengarang mengesyorkan sehingga 25 minit. Ia bergantung kepada kedai.
6) Toskan noda dan basuh smear dengan air suling atau larutan penimbal dalam 7.2.
7) Di atas kertas penyerap, biarkan daun kering, disusun menegak dengan bantuan sokongan.
8) Lap bahagian belakang slaid dengan pad kasa atau kapas yang dicelup dalam alkohol untuk menghilangkan sebarang pewarna.
Utiliti
Teknik pewarnaan Giemsa digunakan dalam beberapa bidang, termasuk: hematologi, mikologi, bakteriologi, parasitologi, sitologi dan sitogenetik.
Hematologi
Ini adalah penggunaan yang paling biasa untuk noda ini. Dengan itu, setiap sel yang terdapat dalam sumsum tulang atau sampel darah periferi boleh dikenal pasti. Selain menganggarkan bilangan sel dalam setiap siri, ia boleh mengesan leukositosis atau leukopenia, trombositopenia, dsb.
Kerana ia sensitif untuk mengenal pasti sel yang tidak matang, ia berguna dalam mendiagnosis leukemia akut atau kronik. Ia juga boleh mendiagnosis anemia seperti penyakit sel sabit, antara lain.
Mikologi
Di kawasan ini, ia adalah perkara biasa untuk digunakan Histoplasma capsulatum (kulat dimorfik intraselular) dalam sampel tisu.
Bakteriologi
Dalam smear hematologi yang diwarnai dengan Giemsa, adalah mungkin untuk dikesan Borrelias sp pada pesakit dengan penyakit yang dipanggil demam berulang. Spirochetes banyak diperhatikan di kalangan eritrosit dalam sampel yang dikumpul pada puncak demam.
Ia juga mungkin untuk menggambarkan bakteria intrasel sebagai Rickettsia sp e Chlamydia trachomatis dalam sel yang dijangkiti.
Parasitologi
Dalam bidang parasitologi, pewarnaan Giemsa telah membolehkan diagnosis penyakit parasit seperti malaria, penyakit Chagas dan leishmaniasis.
Dalam dua parasit pertama, Plasmodium sp e Trypanosoma cruzi, masing-masing, boleh dilihat dalam darah periferal pesakit yang dijangkiti dan boleh didapati dalam pelbagai peringkat bergantung pada peringkat penyakit.
Untuk meningkatkan pencarian parasit dalam darah, disyorkan untuk menggunakan noda Giemsa yang dicampur dengan noda May-Grünwald.
Begitu juga, leishmaniasis kulit boleh didiagnosis dengan menilai sampel biopsi kulit yang diwarnai Giemsa di mana parasit ditemui.
Citologia
Pewarnaan Giemsa juga digunakan untuk kajian sitologi sampel endoserviks, walaupun ia bukan teknik yang paling banyak digunakan untuk tujuan ini.
Walau bagaimanapun, dalam kes kekurangan sumber, ia boleh digunakan, menawarkan fungsi yang serupa dengan Pap smear dan pada kos yang lebih rendah. Namun, ia memerlukan kepakaran daripada pemeriksa.
Sitogenetik
Ciri utama pewarnaan Giemsa ialah keupayaannya untuk mengikat kuat pada kawasan DNA yang kaya dengan adenine dan timin. Ini membolehkan DNA divisualisasikan semasa mitosis sel, dalam keadaan pemeluwapan yang berbeza.
Kajian ini adalah perlu untuk mengesan penyimpangan kromatik, seperti penduaan, pemadaman atau translokasi kawasan berbeza kromosom.
Penyelidikan yang menunjukkan keberkesanan pewarnaan Giemsa
Cannova et al (2016) membandingkan tiga teknik pewarnaan untuk diagnosis leishmaniasis kulit.
Untuk tujuan ini, sampel yang diperoleh daripada haiwan eksperimen telah digunakan ( Mesocrisetus auratus) disuntik secara eksperimen dengan Leishmanias.
Penulis menunjukkan bahawa pewarnaan Giemsa adalah lebih baik daripada pewarnaan Pap-mart® dan Gaffney. Oleh itu, mereka menganggap pewarnaan Giemsa sesuai untuk mendiagnosis leishmaniasis kulit.
Keputusan cemerlang yang diperoleh oleh pengarang adalah disebabkan oleh fakta bahawa gabungan pewarna yang membentuk campuran Giemsa mempunyai syarat yang diperlukan untuk mencipta kontras yang menggalakkan, yang memungkinkan untuk membezakan dengan jelas struktur amastigotes, kedua-dua intra dan ekstraselular.
Teknik lain (Pap-mart® dan Gaffney) juga melakukan ini, tetapi dengan cara yang lebih lemah dan oleh itu lebih sukar untuk digambarkan. Inilah sebabnya mengapa pewarnaan Giemsa disyorkan untuk diagnosis parasitologi leishmaniasis.
Begitu juga, kajian oleh Ramírez et al (1994) menilai kesahihan pewarnaan Giemsa dan Lendrum dalam sapuan konjungtiva untuk mengenal pasti Chlamydia trachomatis.
Penulis menentukan bahawa kesan Giemsa dan Ledrum mempunyai kekhususan yang sama, tetapi Giemsa terbukti lebih sensitif.
Ini menjelaskan mengapa pewarnaan Giemsa pada masa ini paling kerap digunakan untuk diagnosis jangkitan klamidia, terutamanya dalam tetapan yang tidak mempunyai sumber.
Cadangan untuk pewarnaan yang baik
Daun tidak boleh kering terlalu cepat. Anda harus menunggu masa yang sesuai untuk mengeringkannya dengan udara. Lebih kurang 2 jam.
Warnakan segera selepas 2 jam untuk hasil terbaik.
Untuk kotoran menetap dan bercantum dengan lebih baik, sampel hendaklah dihamparkan pada helaian dalam lapisan nipis dan sekata.
Sampel darah pilihan adalah kapilari, kerana smear diambil terus dari titisan darah dan, oleh itu, sampel tidak mengandungi sebarang bahan tambahan, yang memihak kepada penyelenggaraan struktur selular.
Walau bagaimanapun, jika darah vena digunakan, EDTA harus digunakan sebagai antikoagulan dan bukan heparin, kerana yang terakhir biasanya mengubah bentuk sel.
Kesilapan biasa dalam pewarnaan Giemsa
Apabila menggunakan teknik mewarna ini, kesilapan boleh dilakukan. Ini dibuktikan dengan perubahan mendadak dalam warna struktur.
Warna biru sangat
Ia mungkin disebabkan oleh:
- Kotoran yang sangat tebal
- Melebihi masa mewarna
- Basuh tidak mencukupi.
- Penggunaan reagen jauh melebihi pH neutral (beralkali).
Di bawah keadaan ini, warna struktur berikut diputarbelitkan, supaya eritrosit, bukannya mati salmon-merah jambu, akan bertukar menjadi hijau, butiran eosinofil, yang sepatutnya diwarnai merah bata, akan bertukar menjadi kebiruan atau kelabu, dan sebagainya. penyelewengan daripada warna biasa.
Warna merah jambu yang berlebihan
Ia mungkin disebabkan oleh:
- Masa pewarnaan yang tidak mencukupi.
- Pencucian berpanjangan atau berlebihan.
- Tak kering sangat
- Penggunaan reagen yang sangat berasid.
Dalam kes khusus ini, struktur yang biasanya berwarna biru akan hampir tidak kelihatan, manakala struktur yang berwarna merah jambu akan mempunyai warna yang sangat berlebihan.
Contoh: Sel darah merah akan kelihatan merah terang atau oren dalam, kromatin nuklear akan kelihatan merah jambu pucat, dan butiran eosinofil akan mencemarkan merah terang.
Kehadiran mendakan dalam smear
Penyebabnya mungkin:
- Gunakan cadar yang kotor atau tidak dibasuh dengan baik.
- Jangan biarkan noda kering dengan baik.
- Biarkan penyelesaian penetapan untuk masa yang lama.
- Pencucian yang tidak betul pada akhir pewarnaan.
- Penapisan yang tidak mencukupi atau tiada penapisan pewarna yang digunakan.
Kehadiran artifak morfologi
Artifak morfologi mungkin muncul dalam kesan, menjadikannya sukar untuk menggambarkan dan mentafsir struktur. Ini kerana:
- Jenis antikoagulan yang digunakan, seperti heparin.
- Penggunaan daun yang kotor, rosak atau berminyak.
Mod storan
Selepas penyediaan, pewarna hendaklah disimpan pada suhu bilik (15-25°C) untuk mengelakkan pemendakan pewarna. Ia hendaklah disimpan dalam bekas ambar yang tertutup rapat.
Rujukan
- Cannova D, Brito E dan Simons M. Penilaian teknik pewarnaan untuk diagnosis leishmaniasis kulit. Hello . 2016; 20 (2): 24-29.
- PanReac Applichem Reagents ITW. Pewarnaan Giemsa. Versi 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Sepanyol.
- Clark G. Prosedur pewarnaan (1981), ke-4. Williams & Willkins.
- Kimia Klinikal Gunaan. Giemsa Stain untuk Diagnostik in vitro. . Pengedar: cromakit.es
- Ramírez I, Mejía M, García de la Riva J, Hermes F dan Grazioso C. Kesahihan kesan Giemsa dan Lendrum dalam sapuan konjunktiva untuk mengenal pasti Chlamydia trachomatis. Mangkuk Sanit Panam. 1994; 116 (3): 212-216.
- Casas-Rincón G. Mikologi Am. 1994. 2nd Ed. Universiti Pusat Venezuela, Edisi Perpustakaan. Venezuela, Caracas
- "Pewarnaan Giemsa." Wikipedia, Ensiklopedia Percuma . 1 September 2017, pada 01:02 UTC. 6 Disember 2018, en.wikipedia.org.