Giemsa-kleuring is een techniek die in de microbiologie en cytogenetica wordt gebruikt om cellen en weefsels te kleuren, waardoor specifieke structuren zichtbaar worden. Giemsa-kleuring, ontwikkeld door Gustav Giemsa in 1904, is een van de meest gebruikte technieken in diagnostische laboratoria om micro-organismen, parasieten en chromosomen te identificeren.
Voor Giemsa-kleuring zijn materialen nodig zoals Giemsa-kleuring, methanol en gedestilleerd water. De techniek bestaat uit het fixeren van cellen op objectglaasjes, gevolgd door het aanbrengen van Giemsa-kleuring verdund in methanol. Na de kleuring worden de cellen gewassen in gedestilleerd water en onder een microscoop bekeken.
De belangrijkste toepassingen van Giemsa-kleuring zijn onder meer de identificatie van ziekteverwekkers zoals Plasmodium (veroorzaker van malaria), Trypanosoma (veroorzaker van de ziekte van Chagas) en bacteriën zoals Chlamydia en Rickettsia. Daarnaast wordt Giemsa-kleuring veel gebruikt bij chromosoomanalyse om genetische ziekten te diagnosticeren en chromosomale afwijkingen te identificeren.
Stapsgewijze handleiding voor het effectief uitvoeren van Giemsa-kleuring.
Giemsa-kleuring is een essentiële techniek in klinische analyse- en wetenschappelijke onderzoekslaboratoria. Het maakt de visualisatie van verschillende celstructuren, zoals chromosomen, parasieten en bacteriën, mogelijk door de specifieke kleuring van hun componenten. In dit artikel leggen we stap voor stap uit hoe u Giemsa-kleuring effectief kunt uitvoeren.
Stap 1: Bereid een Giemsa-oplossing, die kant-en-klaar verkrijgbaar is of uit poeder kan worden bereid. De oplossing moet worden verdund met gedestilleerd water in de door de fabrikant aanbevolen verhouding.
Stap 2: Fixeer het monster op een objectglaasje met behulp van warmte of fixeermiddelen, zoals ethylalcohol. Zorg ervoor dat het monster goed vastzit om vervorming tijdens het kleuren te voorkomen.
Stap 3: Bedek het gefixeerde preparaat met Giemsa-oplossing en zorg ervoor dat het hele oppervlak gelijkmatig bedekt is. Laat het preparaat gedurende een bepaalde tijd in contact komen met de oplossing, meestal tussen de 10 en 30 minuten.
Stap 4: Spoel het preparaat af onder stromend water om overtollige vlekken te verwijderen. Droog het preparaat voorzichtig af met absorberend papier of perslucht.
Stap 5: Bekijk het gekleurde monster onder een lichtmicroscoop met geschikte vergrotingslenzen. Giemsa-kleuring maakt visualisatie van celstructuren met meer helderheid en contrast mogelijk.
Giemsa-kleuring wordt veel gebruikt in diverse vakgebieden binnen de biologie en geneeskunde, zoals bij het diagnosticeren van parasitaire ziekten, het analyseren van bloedcellen en het identificeren van infectieuze agentia. Door de hierboven beschreven stappen correct te volgen, is het mogelijk om nauwkeurige en betrouwbare resultaten te verkrijgen met Giemsa-kleuring.
Begrijp het Giemsa-kleuringsproces en hoe het precies werkt.
Giemsa-kleuring is een veelgebruikte methode in microbiologische en hematologische laboratoria voor het visualiseren van celstructuren en het detecteren van ziekteverwekkers. Deze methode, ontwikkeld door Gustav Giemsa in 1902, is gebaseerd op de affiniteit van basische en zure kleurstoffen voor verschillende celcomponenten.
De benodigde materialen voor Giemsa-kleuring zijn onder andere Giemsa-kleuring, fixatie- en ontkleuringsoplossingen, objectglaasjes, dekglaasjes en een microscoop. Giemsa-kleuring is een mengsel van methyleenblauw, eosine en glycerine en wordt gebruikt om de celkern- en cytoplasmatische structuren te kleuren.
De Giemsa-kleuringstechniek bestaat uit het fixeren van cellen op een preparaat, gevolgd door een Giemsa-kleuring gedurende een bepaalde tijd. Na de kleuring worden de cellen gewassen met gedestilleerd water en ontkleurd om overtollige kleurstof te verwijderen. Tot slot worden de preparaten gedroogd en onder een microscoop bekeken.
De belangrijkste toepassingen van Giemsa-kleuring zijn onder meer de identificatie van via bloed overgedragen parasieten, zoals Plasmodium spp., en de differentiatie van bloedcellen in perifere bloeduitstrijkjes. Daarnaast wordt deze methode veel gebruikt bij de identificatie van bacteriën, virussen en andere pathogenen in klinische monsters.
De werking ervan is gebaseerd op de affiniteit van basische en zure kleurstoffen met verschillende cellulaire componenten, wat heldere en gedetailleerde beelden onder de microscoop oplevert.
Begrijp de pathologische anatomische procedure met Giemsa-kleuring voor klinische analyse.
Giemsa-kleuring is een techniek die in de pathologische anatomie wordt gebruikt voor de klinische analyse van weefselmonsters. Deze kleuring, ontwikkeld door de Duitse wetenschapper Gustav Giemsa, wordt veel gebruikt vanwege het vermogen om verschillende cellulaire componenten, zoals celkernen, chromosomen en parasieten, te markeren.
Voor Giemsa-kleuring zijn verschillende materialen nodig, waaronder Giemsa-kleuring, spiritus, zoutoplossing en objectglaasjes. De procedure omvat het fixeren van het monster in spiritus, het aanbrengen van Giemsa-kleuring en het wassen met zoutoplossing. Na de kleuring worden de monsters onder een microscoop bekeken voor analyse.
Giemsa-kleuring wordt veel gebruikt in pathologische anatomische laboratoria om verschillende pathologieën te identificeren, zoals parasitaire infecties, leukemie en auto-immuunziekten. De techniek maakt een gedetailleerde analyse van celstructuren mogelijk, wat klinische diagnose en behandelingsmonitoring vergemakkelijkt.
Het gebruik ervan is essentieel voor de diagnose en behandeling van verschillende ziekten. Het is dan ook een onmisbare techniek voor professionals in de gezondheidszorg.
Identificatie van de kleurstof die gebruikt wordt om een bloeduitstrijkje te kleuren.
Giemsa-kleuring is een veelgebruikte methode om verschillende soorten bloedcellen in een bloeduitstrijkje te observeren. De belangrijkste kleurstof die in dit proces wordt gebruikt, is Giemsa-vlek, een mengsel van methyleenblauw, eosine en azuurblauw B. Deze kleurstof is vooral effectief bij het kleuren van structuren zoals celkernen, chromosomen en cytoplasmatische insluitsels.
Giemsa-beits: basis, materialen, techniek en toepassingen
O Giemsa-vlek is een type kleuring voor klinische monsters, gebaseerd op een mengsel van zure en basische kleurstoffen. De ontwikkeling ervan is geïnspireerd op het werk van Romanowsky, waar Gustav Giemsa, een Duitse chemicus en bacterioloog, de kleuring perfectioneerde door glycerol toe te voegen om de verbindingen te stabiliseren.
Door de wijzigingen die we aanbrachten in de oorspronkelijke techniek van Romanowsky konden we de microscopische observaties aanzienlijk verbeteren. Daarom werd de techniek Giemsa-kleuring genoemd.
Omdat het een eenvoudige, zeer functionele en economische techniek is, wordt het momenteel veelvuldig gebruikt in klinische laboratoria voor hematologische uitstrijkjes, beenmergmonsters en weefselsecties.
De Giemsa-kleuringstechniek is zeer nuttig voor cytologisch onderzoek, omdat het de observatie van specifieke celstructuren mogelijk maakt. Deze techniek kleurt het cytoplasma, de celkernen, nucleoli, vacuolen en granula van cellen, waardoor fijne sporen van chromatine zichtbaar worden.
Bovendien kunnen er significante veranderingen in de grootte, vorm en kleur van de kern worden waargenomen, waardoor het mogelijk is het verlies van de relatie tussen kern en cytoplasma te visualiseren.
Aan de andere kant maakt het de identificatie van onrijpe cellen in het beenmerg en perifeer bloed mogelijk, wat belangrijk is voor de diagnose van ernstige ziekten zoals leukemie. Het maakt ook de detectie van hemoparasieten, extracellulaire en intracellulaire bacteriën, schimmels en andere pathogenen mogelijk.
In de cytogenetica wordt het veel gebruikt, omdat het de mogelijkheid biedt om celmitose te bestuderen.
Giemsa vlekkenfundering
Romanowsky-kleuringen maken gebruik van een contrast tussen zure en basische kleurstoffen om respectievelijk basische en zure structuren te kleuren. Zoals te zien is, hebben zure kleurstoffen een affiniteit voor het kleuren van basische structuren en vice versa.
De basiskleurstof die gebruikt wordt is methyleenblauw en de geoxideerde derivaten daarvan (Azure A en Azure B), terwijl de zure kleurstof eosine is.
De zure structuren van de cellen bestaan onder andere uit nucleïnezuren en gesegmenteerde basofiele korrels en worden daarom gekleurd met methyleenblauw.
In dezelfde zin zijn de basisstructuren van cellen hemoglobine en enkele korrels, zoals die welke in gesegmenteerde eosinofielen zitten. Deze worden gekleurd met eosine.
Daarentegen worden methyleenblauw en hemelsblauw gekarakteriseerd als metachromatische kleurstoffen. Ze kunnen een variabele toon aan verschillende structuren geven, afhankelijk van de polyanionlading die ze bezitten.
Op deze manier kan door de strategische combinatie van basische en zure kleurstoffen een breed spectrum aan kleuren ontstaan, afhankelijk van de biochemische eigenschappen van de betreffende structuur. Bij zure structuren kan het gaan om tinten van lichtblauw, donkerblauw, lila en paars.
Hoewel de kleur die eosine geeft stabieler is, ontstaan er kleuren variërend van roodachtig oranje tot zalmkleurig.
Materialen
Materialen voor het bereiden van de stamoplossing
Voor de bereiding van de stamoplossing weegt u 600 mg Giemsa-poeder af, meet u 500 ml acetonvrije methylalcohol en 50 ml neutrale glycerine af.
Methode voor het bereiden van de stamoplossing
Doe het afgewogen Giemsa-poeder in een vijzel. Als er klontjes zijn, moeten deze worden verpulverd. Voeg vervolgens een flinke hoeveelheid van de afgemeten glycerine toe en meng grondig. Giet het mengsel in een zeer schone amberkleurige fles.
Voeg de resterende glycerine toe aan de mortel. Meng nogmaals om eventuele resterende kleurstof die aan de mortelwanden is blijven plakken te verwijderen en giet het vervolgens in dezelfde fles.
De fles wordt afgedekt en gedurende 2 uur in een waterbad bij 55 °C vervoerd. Roer het mengsel tijdens het baden elk half uur lichtjes door.
Laat het mengsel vervolgens afkoelen voordat de alcohol wordt toegevoegd. Een deel van de afgemeten alcohol wordt eerst aan de mortel toegevoegd om de resterende kleurstof weg te spoelen en wordt vervolgens samen met de resterende alcohol aan het mengsel toegevoegd.
Deze bereiding moet minimaal 2 weken rijpen. Het deel dat in de moederloog wordt gebruikt, moet worden gefilterd.
Om besmetting van het preparaat te voorkomen, is het raadzaam om het deel dat continu gebruikt wordt over te brengen naar een klein amberkleurig flesje met druppelaar. Vul het flesje bij telkens wanneer het reagens op is.
Materialen voor het bereiden van de bufferoplossing
Een bufferoplossing met pH 7,2 wordt daarentegen als volgt bereid:
6,77 g natriumfosfaat (watervrij) (gewogen NaHPO 4 ), 2,59 g kaliumdiwaterstoffosfaat (KH 2 PO 4 ), en gedestilleerd water tot 1000 ml.
Laatste kleurstofvoorbereiding
Om de uiteindelijke kleuroplossing te bereiden, meet u 2 ml van de gefilterde stamoplossing af en mengt u deze met 6 ml bufferoplossing. Het mengsel wordt geschud.
Een relevant feit dat in overweging moet worden genomen, is dat de technieken voor het bereiden van kleurstoffen kunnen verschillen, afhankelijk van de commerciële installatie.
Extra materialen nodig om de kleur te maken
Naast de beschreven materialen moeten er gekleurde bruggen, t-shirts met water of een tampon om de kleding te wassen, lakens met voorwerpen of hoezen, een timer om de kleurtijd te regelen en droogpapier of een materiaal dat dient om te drogen (gaas of katoen) aanwezig zijn.
techniek
Kleurproces
1) Voordat het monster wordt gekleurd, moet het op een schoon objectglaasje worden uitgespreid.
De monsters kunnen bestaan uit bloed, beenmerg, histologische weefselcoupes of cervix-vaginale monsters. Het wordt aanbevolen om de pasta's dun te maken en 1 tot 2 uur te laten drogen voordat u ze kleurt.
2) Op een kleurbrug worden alle gekleurde bladeren geplaatst. Het werkt altijd in dezelfde volgorde en elk blad is duidelijk gelabeld.
3) Doe een paar druppels 100% methylalcohol (methanol) op het uitstrijkje en laat het 3 tot 5 minuten intrekken om het monster te fixeren en te dehydrateren.
4) Gooi de methanol die nog op het blad zit weg en laat het aan de lucht drogen.
5) Voeg na het drogen de laatste kleuroplossing toe met een druppelaar totdat het hele blad bedekt is. Laat het 15 minuten intrekken. Sommige auteurs raden tot 25 minuten aan. Dit hangt af van de winkel.
6) Laat de vlek uitlekken en was de veeg met gedestilleerd water of een bufferoplossing in 7.2.
7) Laat de bladeren op absorberend papier aan de lucht drogen, waarbij u ze verticaal legt met behulp van een steun.
8) Veeg de achterkant van het preparaat schoon met een gaasje of wattenstaafje gedrenkt in alcohol om eventuele kleurstof te verwijderen.
Nutsvoorzieningen
De Giemsa-kleuringstechniek wordt op verschillende gebieden gebruikt, waaronder: hematologie, mycologie, bacteriologie, parasitologie, cytologie en cytogenetica.
hematologie
Dit is de meest voorkomende toepassing van deze kleuring. Hiermee kan elke cel in het beenmerg of in perifere bloedmonsters worden geïdentificeerd. Naast het schatten van het aantal cellen in elke reeks, kan het ook leukocytose of leukopenie, trombocytopenie, enz. detecteren.
Omdat het gevoelig is voor het identificeren van onrijpe cellen, is het nuttig bij het diagnosticeren van acute of chronische leukemie. Het kan ook bloedarmoede zoals sikkelcelziekte diagnosticeren.
Mycologie
Op dit gebied is het gebruikelijk om Histoplasma capsulatum (intracellulaire dimorfe schimmel) in weefselmonsters.
Bacteriologie
In hematologische uitstrijkjes gekleurd met Giemsa is het mogelijk om Borrelia's sp Bij patiënten met een ziekte die relapsing fever wordt genoemd. Spirocheten worden veelvuldig aangetroffen tussen rode bloedcellen in monsters die op het hoogtepunt van de koorts zijn genomen.
Het is ook mogelijk om intracellulaire bacteriën te visualiseren als Rickettsia sp e Chlamydia trachomatis in geïnfecteerde cellen.
parasitologie
Op het gebied van parasitologie is de Giemsa-kleuring gebruikt voor de diagnose van parasitaire ziekten zoals malaria, de ziekte van Chagas en leishmaniasis.
Bij de eerste twee parasieten, Plasmodium sp e Trypanosoma cruzi, respectievelijk te zien in het perifere bloed van geïnfecteerde patiënten en kunnen in verschillende stadia worden aangetroffen, afhankelijk van het stadium van de ziekte.
Om de zoektocht naar parasieten in het bloed te verbeteren, wordt aanbevolen om Giemsa-kleuring gemengd met May-Grünwald-kleuring te gebruiken.
Op vergelijkbare wijze kan cutane leishmaniasis worden gediagnosticeerd door het beoordelen van met Giemsa gekleurde huidbiopten waarin de parasiet is aangetroffen.
Cytologie
Giemsa-kleuring wordt ook gebruikt voor cytologisch onderzoek van endocervicale monsters, hoewel het voor dit doel niet de meest gebruikte techniek is.
Bij beperkte middelen kan het echter wel worden gebruikt, met een vergelijkbare functionaliteit als het uitstrijkje, maar dan tegen lagere kosten. Het vereist echter wel expertise van de onderzoeker.
Cytogenetica
Een belangrijk kenmerk van Giemsa-kleuring is het vermogen om zich sterk te binden aan DNA-gebieden die rijk zijn aan adenine en thymine. Dit maakt visualisatie van DNA mogelijk tijdens de celmitose, in verschillende condensatiestadia.
Deze onderzoeken zijn nodig om chromatische afwijkingen, zoals duplicaties, deleties of translocaties van andere chromosoomgebieden, op te sporen.
Onderzoek dat de effectiviteit van Giemsa-kleuring aantoont
Cannova et al (2016) vergeleken drie kleuringstechnieken voor de diagnose van cutane leishmaniasis.
Voor dit doel werden monsters gebruikt die afkomstig waren van een proefdier ( Mesocrisetus auratus) experimenteel geënt met Leishmania's.
De auteurs toonden aan dat Giemsa-kleuring beter was dan Pap-mart®- en Gaffney-kleuring. Daarom beschouwden ze Giemsa-kleuring als ideaal voor de diagnose van cutane leishmaniasis.
De uitstekende resultaten die de auteurs hebben behaald, zijn te danken aan het feit dat de combinatie van kleurstoffen waaruit het Giemsa-mengsel bestaat, over de nodige omstandigheden beschikt om een gunstig contrast te creëren, waardoor de structuren van de amastigoten duidelijk kunnen worden onderscheiden, zowel intra- als extracellulair.
De andere technieken (Pap-mart® en Gaffney) deden dit ook, maar op een zwakkere manier en daardoor moeilijker te visualiseren. Daarom wordt Giemsa-kleuring aanbevolen voor de parasitologische diagnose van leishmaniasis.
Op dezelfde manier heeft een onderzoek van Ramírez et al (1994) de validiteit van Giemsa- en Lendrum-kleuringen in conjunctiva-uitstrijkjes geëvalueerd voor de identificatie van Chlamydia trachomatis.
De auteurs stelden vast dat Giemsa- en Ledrum-kleuringen dezelfde specificiteit hebben, maar Giemsa bleek gevoeliger.
Dit verklaart waarom Giemsa-kleuring momenteel het meest wordt gebruikt voor de diagnose van chlamydia-infecties, vooral in gebieden met weinig middelen.
Aanbevelingen voor een goede kleuring
De bladeren mogen niet te snel drogen. Wacht voldoende lang om ze aan de lucht te laten drogen. Ongeveer 2 uur.
Voor het beste resultaat direct na 2 uur kleuren.
Om ervoor te zorgen dat de vlekken beter hechten en mengen, moet het monster in een dunne, gelijkmatige laag over het vel worden uitgespreid.
Het beste is om het bloedmonster capillair af te nemen, omdat het uitstrijkje rechtstreeks uit de bloeddruppel wordt genomen en het monster dus geen additieven bevat, wat het behoud van de celstructuren bevordert.
Wanneer echter veneus bloed wordt gebruikt, moet EDTA als anticoagulans worden gebruikt en niet heparine, omdat heparine de cellen vaak vervormt.
Veelvoorkomende fouten bij Giemsa-kleuring
Bij het gebruik van deze kleurtechniek kunnen fouten ontstaan, die zich uiten in plotselinge kleurveranderingen van de constructie.
Extreem blauwe kleuring
Het kan komen door:
- Zeer dikke vlekken
- Overschrijding van de kleurtijd
- Onvoldoende wassen.
- Gebruik van reagentia met een pH-waarde die ver boven de neutrale (alkalische) pH ligt.
Onder deze omstandigheden worden de kleuren van de volgende structuren vervormd, zodat rode bloedcellen niet zalmroze maar groen worden, eosinofiele korrels, die eigenlijk baksteenrood gekleurd zouden moeten zijn, blauwachtig of grijs worden, enzovoort. afwijking van de gebruikelijke tinten.
Overmatig roze kleuring
Het kan komen door:
- Onvoldoende kleuringstijd.
- Langdurig of overmatig wassen.
- Niet erg droog
- Gebruik van zeer zure reagentia.
In dit specifieke geval zullen structuren die normaal gesproken blauw gekleurd zijn, nauwelijks zichtbaar zijn, terwijl structuren die roze gekleurd zijn, zeer overdreven tinten zullen hebben.
Bijvoorbeeld: Rode bloedcellen worden felrood of dieporanje, kernchromatine wordt lichtroze en eosinofiele korrels kleuren felrood.
Aanwezigheid van neerslag in het uitstrijkje
De oorzaken kunnen zijn:
- Gebruik vuile of slecht gewassen lakens.
- Laat de vlek niet goed drogen.
- Laat de fixeeroplossing geruime tijd inwerken.
- Onjuist wassen aan het einde van het kleuren.
- Onvoldoende of geen filtratie van de gebruikte kleurstof.
Aanwezigheid van morfologische artefacten
Morfologische artefacten kunnen in de vlekken voorkomen, waardoor het moeilijk is om de structuren te visualiseren en te interpreteren. Dit komt doordat:
- Het soort anticoagulans dat gebruikt wordt, bijvoorbeeld heparine.
- Gebruik van vuile, beschadigde of olieachtige bladeren.
Opslagmodus
Na bereiding moet de kleurstof op kamertemperatuur (15-25 °C) worden bewaard om kleurstofneerslag te voorkomen. Bewaar de kleurstof in een goed gesloten amberkleurige verpakking.
Referências
- Cannova D, Brito E en Simons M. Evaluatie van kleuringstechnieken voor de diagnose van cutane leishmaniasis. Salus . 2016; 20 (2): 24-29.
- PanReac Applichem-reagentia ITW. Giemsa-kleuring. Versie 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Valles, Spanje.
- Clark G. Kleuringsprocedures (1981), 4e. Williams & Willkins.
- Toegepaste klinische chemie. Giemsa-kleuring voor diagnostiek. in vitro . Distributeur: cromakit.es
- Ramírez I, Mejía M, García de la Riva J, Hermes F en Grazioso C. Geldigheid van Giemsa- en Lendrum-kleuringen in conjunctiva-uitstrijkjes voor de identificatie van Chlamydia trachomatis. Sanit Panam Kom. 1994; 116 (3): 212-216.
- Casas-Rincón G. Algemene mycologie. 1994. 2e editie. Centrale Universiteit van Venezuela, bibliotheekedities. Venezuela, Caracas
- «Giemsa-kleuring.» Wikipedia, de vrije encyclopedie 1 september 2017, om 01:02 UTC. 6 december 2018, en.wikipedia.org.