Barwienie Giemsy to technika stosowana w mikrobiologii i cytogenetyce do barwienia komórek i tkanek, umożliwiająca wizualizację specyficznych struktur. Opracowana przez Gustava Giemsę w 1904 roku, technika barwienia Giemsy jest jedną z najczęściej stosowanych technik w laboratoriach diagnostycznych do identyfikacji mikroorganizmów, pasożytów i chromosomów.
Barwienie metodą Giemsy wymaga takich materiałów, jak barwnik Giemsy, metanol i woda destylowana. Technika ta polega na utrwaleniu komórek na szkiełkach mikroskopowych, a następnie nałożeniu barwnika Giemsy rozcieńczonego w metanolu. Po barwieniu komórki są płukane w wodzie destylowanej i obserwowane pod mikroskopem.
Główne zastosowania barwienia Giemsą obejmują identyfikację patogenów, takich jak Plasmodium (powodujący malarię), Trypanosoma (wywołujący chorobę Chagasa) oraz bakterii, takich jak Chlamydia i Rickettsia. Ponadto barwienie Giemsą jest szeroko stosowane w analizie chromosomów w celu diagnozowania chorób genetycznych i identyfikacji nieprawidłowości chromosomowych.
Instrukcja krok po kroku, jak skutecznie wykonać barwienie metodą Giemsy.
Barwienie metodą Giemsy to niezbędna technika w laboratoriach analizy klinicznej i badań naukowych. Umożliwia ono wizualizację różnych struktur komórkowych, takich jak chromosomy, pasożyty i bakterie, poprzez specyficzne barwienie ich składników. W tym artykule wyjaśnimy krok po kroku, jak skutecznie wykonać barwienie metodą Giemsy.
Krok 1: Przygotuj roztwór Giemsy, który można kupić gotowy lub przygotować z proszku. Roztwór należy rozcieńczyć w wodzie destylowanej w proporcjach zalecanych przez producenta.
Krok 2: Utrwal próbkę na szkiełku podstawowym za pomocą ciepła lub utrwalacza, takiego jak alkohol etylowy. Upewnij się, że próbka jest solidnie zamocowana, aby uniknąć zniekształceń podczas barwienia.
Krok 3: Pokryj utrwalony preparat roztworem Giemsy, upewniając się, że cała powierzchnia jest równomiernie pokryta. Pozostaw preparat w kontakcie z roztworem na określony czas, zazwyczaj od 10 do 30 minut.
Krok 4: Opłucz szkiełko pod bieżącą wodą, aby usunąć nadmiar plamy. Delikatnie osusz szkiełko papierem ściernym lub sprężonym powietrzem.
Krok 5: Obserwuj zabarwioną próbkę pod mikroskopem świetlnym, używając odpowiednich obiektywów powiększających. Barwienie metodą Giemsy pozwoli na uwidocznienie struktur komórkowych z większą przejrzystością i kontrastem.
Barwienie metodą Giemsy jest szeroko stosowane w różnych dziedzinach biologii i medycyny, takich jak diagnostyka chorób pasożytniczych, analiza komórek krwi i identyfikacja czynników zakaźnych. Prawidłowe przestrzeganie powyższych kroków pozwala uzyskać dokładne i wiarygodne wyniki barwienia metodą Giemsy.
Poznaj szczegółowo proces barwienia metodą Giemsy i jego działanie.
Barwienie metodą Giemsy to metoda szeroko stosowana w laboratoriach mikrobiologicznych i hematologicznych do obrazowania struktur komórkowych i wykrywania patogenów. Opracowana przez Gustava Giemsę w 1902 roku, metoda ta opiera się na powinowactwie barwników zasadowych i kwasowych do różnych składników komórkowych.
Materiały potrzebne do barwienia metodą Giemsy obejmują barwnik Giemsy, roztwory utrwalające i odbarwiające, szkiełka podstawowe, szkiełka nakrywkowe oraz mikroskop. Barwnik Giemsy to mieszanina błękitu metylenowego, eozyny i gliceryny, stosowana do barwienia struktur jądrowych i cytoplazmatycznych komórek.
Technika barwienia Giemsy polega na utrwaleniu komórek na szkiełku, a następnie nałożeniu barwnika Giemsy na określony czas. Po barwieniu komórki przemywa się wodą destylowaną i odbarwia w celu usunięcia nadmiaru barwnika. Na koniec szkiełka suszy się i obserwuje pod mikroskopem.
Główne zastosowania barwienia Giemsy obejmują identyfikację pasożytów przenoszonych przez krew, takich jak Plasmodium spp., oraz różnicowanie komórek krwi w rozmazach krwi obwodowej. Ponadto metoda ta jest szeroko stosowana do identyfikacji bakterii, wirusów i innych patogenów w próbkach klinicznych.
Jego działanie opiera się na powinowactwie barwników zasadowych i kwasowych do różnych składników komórkowych, co pozwala na uzyskanie wyraźnych i szczegółowych obrazów pod mikroskopem.
Poznaj procedurę anatomii patologicznej z wykorzystaniem barwienia Giemsą w analizie klinicznej.
Barwienie metodą Giemsy to technika stosowana w patologii anatomicznej do analizy klinicznej próbek tkanek. Opracowana przez niemieckiego naukowca Gustava Giemsę, metoda ta jest szeroko stosowana ze względu na zdolność do uwidocznienia różnych składników komórkowych, takich jak jądra komórkowe, chromosomy i pasożyty.
Barwienie metodą Giemsy wymaga użycia szeregu materiałów, w tym barwnika Giemsy, spirytusu metylowego, roztworu soli fizjologicznej oraz szkiełek mikroskopowych. Procedura obejmuje utrwalenie próbki w spirytusie metylowym, nałożenie barwnika Giemsy i przemycie roztworem soli fizjologicznej. Po barwieniu próbki są obserwowane pod mikroskopem w celu analizy.
Barwienie metodą Giemsy jest szeroko stosowane w laboratoriach anatomiczno-patologicznych do identyfikacji różnych patologii, takich jak zakażenia pasożytnicze, białaczka i choroby autoimmunologiczne. Technika ta umożliwia szczegółową analizę struktur komórkowych, ułatwiając diagnostykę kliniczną i monitorowanie leczenia.
Jej zastosowanie jest niezbędne do diagnozowania i leczenia różnorodnych chorób, co czyni ją niezastąpioną techniką dla pracowników służby zdrowia.
Identyfikacja barwnika użytego do barwienia rozmazu krwi.
Barwienie metodą Giemsy to powszechna metoda stosowana do obserwacji różnych rodzajów komórek krwi w rozmazie krwi. Głównym barwnikiem używanym w tym procesie jest Barwienie Giemsy, który jest mieszaniną błękitu metylenowego, eozyny i lazuru B. Barwnik ten jest szczególnie skuteczny w barwieniu struktur takich jak jądra komórkowe, chromosomy i inkluzje cytoplazmatyczne.
Bejca Giemsy: podstawy, materiały, technika i zastosowania
O Barwienie Giemsy to rodzaj barwienia próbek klinicznych, oparty na mieszaninie barwników kwasowych i zasadowych. Jego powstanie zostało zainspirowane pracami Romanowskiego, gdzie Gustav Giemsa, niemiecki chemik i bakteriolog, udoskonalił go, dodając glicerol w celu stabilizacji związków.
Zmiany wprowadzone do oryginalnej techniki Romanowsky’ego pozwoliły nam znacząco udoskonalić obserwacje mikroskopowe, dlatego też technikę tę nazwano barwieniem Giemsy.
Ponieważ jest to prosta, wysoce funkcjonalna i ekonomiczna technika, jest ona obecnie powszechnie stosowana w laboratoriach klinicznych do pobierania rozmazów hematologicznych, próbek szpiku kostnego i przekrojów tkanek.
Technika barwienia Giemsy jest bardzo przydatna w badaniach cytologicznych, ponieważ umożliwia obserwację specyficznych struktur komórkowych. Technika ta barwi cytoplazmy, jądra komórkowe, jąderka, wakuole i ziarnistości komórek, umożliwiając rozróżnienie drobnych śladów chromatyny.
Ponadto można wykryć znaczące zmiany wielkości, kształtu lub koloru jądra, co pozwala na uwidocznienie utraty relacji pomiędzy jądrem a cytoplazmą.
Z drugiej strony, pozwala na identyfikację niedojrzałych komórek w szpiku kostnym i krwi obwodowej, co jest istotne w diagnostyce poważnych chorób, takich jak białaczka. Pozwala również na wykrycie pasożytów krwi, bakterii zewnątrz- i wewnątrzkomórkowych, grzybów i innych patogenów.
W cytogenetyce jest szeroko stosowana, gdyż umożliwia badanie mitozy komórek.
Podkład barwiący Giemsa
Barwienia typu Romanowskiego wykorzystują kontrast między barwnikami kwaśnymi i zasadowymi, aby zabarwić odpowiednio struktury zasadowe i kwaśne. Jak widać, barwniki kwaśne mają powinowactwo do barwienia struktur zasadowych i odwrotnie.
Podstawowym barwnikiem jest błękit metylenowy i jego utlenione pochodne (lazur A i lazur B), natomiast barwnikiem kwasowym jest eozyna.
Kwasowe struktury komórek to m.in. kwasy nukleinowe i segmentowane granulki bazofili, dlatego barwi się je błękitem metylenowym.
Podobnie, podstawowymi strukturami komórek są hemoglobina i niektóre granulki, takie jak te zawarte w segmentowanych eozynofilach i inne; zostaną one zabarwione eozyną.
Z drugiej strony, ponieważ błękit metylenowy i błękit nieba są barwnikami metachromatycznymi, mogą nadawać zmienny odcień różnym strukturom, zależnie od posiadanego ładunku polianionowego.
W ten sposób strategiczne połączenie barwników zasadowych i kwasowych może pozwolić na uzyskanie szerokiego spektrum kolorów, w zależności od biochemicznych właściwości każdej struktury, od odcieni jasnoniebieskiego, ciemnoniebieskiego, liliowego i fioletowego w przypadku struktur kwasowych.
Chociaż kolor uzyskiwany dzięki eozynie jest bardziej stabilny, daje on odcienie od czerwono-pomarańczowego do łososiowego.
Materiały
Materiały do przygotowania roztworu macierzystego
Przygotowanie roztworu macierzystego wymaga odważenia 600 mg proszku Giemsy, odmierzenia 500 ml alkoholu metylowego bez acetonu i 50 ml neutralnej gliceryny.
Metoda przygotowania roztworu macierzystego
Odważoną ilość proszku Giemsy wsyp do moździerza. Jeśli są jakieś grudki, należy je rozdrobnić. Następnie dodaj sporą ilość odmierzonej gliceryny i dokładnie wymieszaj. Przelej powstałą mieszaninę do bardzo czystej bursztynowej butelki.
Pozostałą glicerynę dodaje się do zaprawy. Ponownie miesza, aby usunąć resztki barwnika, które przywarły do ścianek zaprawy, a następnie wlewa do tej samej butelki.
Butelkę przykrywamy i transportujemy przez 2 godziny w łaźni wodnej o temperaturze 55°C. Podczas pobytu w łaźni wodnej, mieszamy delikatnie mieszaninę co pół godziny.
Następnie mieszaninę pozostawia się do ostygnięcia przed dodaniem alkoholu. Najpierw dodaje się część odmierzonego alkoholu do zaprawy, aby dokończyć wypłukiwanie resztek barwnika, a następnie dodaje się go do mieszanki wraz z pozostałym alkoholem.
Preparat należy pozostawić do dojrzewania na co najmniej 2 tygodnie. Część użytą w roztworze macierzystym należy przefiltrować.
Aby uniknąć zanieczyszczenia preparatu, zaleca się przelanie części, która będzie stale używana, do małej, bursztynowej butelki z kroplomierzem. Uzupełniać po każdym wyczerpaniu odczynnika.
Materiały do przygotowania roztworu buforowego
Z drugiej strony, roztwór buforowy o pH 7,2 przygotowuje się w następujący sposób:
6,77 g fosforanu sodu (bezwodnego) (ważonego NaHPOXNUMX) 4 ), 2,59 g diwodorofosforanu potasu (KH 2 PO 4 ) i wody destylowanej do 1000 ml.
Ostateczne przygotowanie barwnika
Aby przygotować końcowy roztwór barwiący, odmierz 2 ml przefiltrowanego roztworu macierzystego i wymieszaj go z 6 ml roztworu buforowego. Mieszaninę wstrząsa się.
Istotnym faktem, który należy wziąć pod uwagę, jest to, że techniki przygotowywania barwników mogą się różnić w zależności od instalacji komercyjnej.
Dodatkowe materiały potrzebne do wykonania koloryzacji
Oprócz wymienionych materiałów, potrzebne są kolorowe mostki, koszulki z wodą lub tampon do prania ubrań, prześcieradła z przedmiotami lub pokrowcami, minutnik do kontrolowania czasu farbowania i bibułki lub jakiś materiał służący do suszenia (gaza lub wata).
Technika
Proces koloryzacji
1) Przed barwieniem próbkę należy rozłożyć na czystym szkiełku.
Próbki mogą obejmować krew, szpik kostny, wycinki histologiczne lub próbki z szyjki macicy i pochwy. Zaleca się, aby pasty były rzadkie i pozostawione do wyschnięcia na 1 do 2 godzin przed barwieniem.
2) Na moście do kolorowania umieszczane są wszystkie kolorowe liście. Zawsze działa to w tej samej kolejności, a każdy liść jest wyraźnie opisany.
3) Nanieść kilka kropli 100% alkoholu metylowego (metanolu) na rozmaz i pozostawić na 3 do 5 minut w celu utrwalenia i odwodnienia próbki.
4) Wylej pozostały na liściu metanol i pozostaw go do wyschnięcia na powietrzu.
5) Po wyschnięciu, dodaj końcowy roztwór barwiący za pomocą kroplomierza, aż pokryje cały liść. Pozostaw na 15 minut. Niektórzy autorzy zalecają do 25 minut. Zależy to od sklepu.
6) Odsącz plamę i przemyj rozmaz wodą destylowaną lub roztworem buforowym w 7.2.
7) Pozostaw liście na papierze chłonnym, układając je pionowo i pomagając sobie podpórką, do wyschnięcia na powietrzu.
8) Przetrzyj tylną stronę szkiełka gazikiem lub wacikiem nasączonym alkoholem, aby usunąć ewentualny barwnik.
Narzędzia
Technika barwienia Giemsy jest stosowana w wielu dziedzinach, m.in.: hematologii, mykologii, bakteriologii, parazytologii, cytologii i cytogenetyce.
Hematologia
To najczęstsze zastosowanie tego barwnika. Za jego pomocą można zidentyfikować każdą komórkę obecną w próbkach szpiku kostnego lub krwi obwodowej. Oprócz oszacowania liczby komórek w każdej serii, barwnik ten może wykryć leukocytozę, leukopenię, trombocytopenię itp.
Ponieważ jest czuły na identyfikację niedojrzałych komórek, jest przydatny w diagnostyce ostrej lub przewlekłej białaczki. Może również diagnozować niedokrwistości, takie jak anemia sierpowata i inne.
Mikologia
W tym obszarze powszechnie stosuje się Histoplasma capsulatum (wewnątrzkomórkowy grzyb dimorficzny) w próbkach tkanek.
Bakteriologia
W rozmazach hematologicznych barwionych metodą Giemsy możliwe jest wykrycie Borrelias sp U pacjentów z chorobą zwaną nawracającą gorączką. Krętki są licznie obserwowane wśród erytrocytów w próbkach pobranych w szczytowym momencie gorączki.
Możliwa jest również wizualizacja bakterii wewnątrzkomórkowych jako Rickettsia sp e Chlamydia trachomatis w zakażonych komórkach.
Parazytologia
W dziedzinie parazytologii barwienie Giemsy pozwoliło na diagnostykę chorób pasożytniczych, takich jak malaria, choroba Chagasa i leiszmanioza.
W przypadku pierwszych dwóch pasożytów, Plasmodium sp e Trypanosoma cruzi, odpowiednio, można je zaobserwować we krwi obwodowej zakażonych pacjentów i mogą występować w różnych stadiach, w zależności od stopnia zaawansowania choroby.
Aby poprawić wykrywalność pasożytów we krwi, zaleca się stosowanie barwienia Giemsy zmieszanego z barwieniem May-Grünwalda.
Podobnie, leiszmaniozę skórną można zdiagnozować poprzez ocenę wycinków skóry barwionych metodą Giemsy, w których znaleziono pasożyta.
Cytologia
Barwienie Giemsy stosuje się również w badaniach cytologicznych próbek kanału szyjki macicy, choć nie jest to najpowszechniej stosowana technika w tym celu.
Jednak w przypadku niedoboru zasobów można z niej skorzystać, oferując funkcjonalność podobną do badania cytologicznego, a przy tym niższą cenę. Wymaga to jednak specjalistycznej wiedzy od osoby przeprowadzającej badanie.
Cytogenetyka
Kluczową cechą barwienia Giemsy jest jego zdolność do silnego wiązania się z regionami DNA bogatymi w adeninę i tyminę. Pozwala to na wizualizację DNA podczas mitozy komórkowej, w różnych stanach kondensacji.
Badania te są konieczne w celu wykrycia aberracji chromatycznych, takich jak duplikacje, delecje lub translokacje różnych regionów chromosomów.
Badania wykazujące skuteczność barwienia metodą Giemsy
Cannova i wsp. (2016) porównali trzy techniki barwienia w diagnostyce leiszmaniozy skórnej.
W tym celu wykorzystano próbki pobrane od zwierzęcia doświadczalnego ( Mesocrisetus auratus) eksperymentalnie zaszczepiono grzybem Leishmania.
Autorzy wykazali, że barwienie metodą Giemsy jest skuteczniejsze niż barwienie metodą Pap-mart® i Gaffneya. Dlatego uznali barwienie metodą Giemsy za idealne do diagnozowania leiszmaniozy skórnej.
Doskonałe wyniki uzyskane przez autorów wynikają z faktu, że kombinacja barwników wchodzących w skład mieszaniny Giemsy spełnia warunki umożliwiające uzyskanie korzystnego kontrastu, dzięki czemu możliwe jest wyraźne rozróżnienie struktur amastigotów, zarówno wewnątrz-, jak i zewnątrzkomórkowo.
Pozostałe techniki (Pap-mart® i Gaffney) również to umożliwiały, ale w słabszy sposób i dlatego były trudniejsze do uwidocznienia. Dlatego w diagnostyce parazytologicznej leiszmaniozy zaleca się barwienie metodą Giemsy.
Podobnie w badaniu przeprowadzonym przez Ramíreza i in. (1994) oceniono trafność barwienia metodą Giemsy i Lendruma w rozmazach spojówek w celu identyfikacji Chlamydiatrachomatis.
Autorzy ustalili, że barwienia Giemsy i Ledruma mają taką samą swoistość, ale barwienie Giemsy okazało się bardziej czułe.
Wyjaśnia to, dlaczego barwienie metodą Giemsy jest obecnie najczęściej stosowaną metodą w diagnostyce zakażeń chlamydiowych, szczególnie w miejscach o ograniczonym dostępie do środków.
Rekomendacje dotyczące dobrego kolorowania
Liści nie należy suszyć zbyt szybko. Należy odczekać odpowiedni czas, aby wyschły na powietrzu. Około 2 godziny.
Aby uzyskać najlepsze efekty, farbuj od razu po 2 godzinach.
Aby plamy lepiej się utrwaliły i wymieszały, próbkę należy rozprowadzić na kartce cienką, równomierną warstwą.
Preferowaną próbką krwi jest próbka kapilarna, ponieważ rozmaz pobierany jest bezpośrednio z kropli krwi, a zatem próbka nie zawiera żadnych dodatków, co sprzyja zachowaniu struktur komórkowych.
Jeśli jednak stosuje się krew żylną, jako antykoagulant należy stosować EDTA, a nie heparynę, ponieważ ta ostatnia zwykle powoduje deformację komórek.
Typowe błędy w barwieniu metodą Giemsy
Stosując tę technikę kolorowania, można popełnić błędy. Ich objawem są nagłe zmiany odcienia struktury.
Ekstremalnie niebieskie ubarwienie
Może to być spowodowane:
- Bardzo gęste plamy
- Przekroczenie czasu koloryzacji
- Niedostateczne mycie.
- Stosowanie odczynników o odczynie znacznie wyższym od neutralnego (zasadowego) pH.
W takich warunkach kolory następujących struktur ulegają zniekształceniu, wskutek czego erytrocyty zamiast zabarwić się na łososiowo-różowo, staną się zielone, granulki eozynofili, które powinny być zabarwione na ceglastoczerwono, staną się niebieskawe lub szare itd. dochodzi do znacznych odchyleń od typowych odcieni.
Nadmiernie różowe zabarwienie
Może to być spowodowane:
- Niewystarczający czas barwienia.
- Długotrwałe lub nadmierne mycie.
- Niezbyt suche
- Stosowanie bardzo kwaśnych odczynników.
W tym konkretnym przypadku struktury, które zazwyczaj są zabarwione na niebiesko, będą ledwo widoczne, podczas gdy struktury zabarwione na różowo będą miały bardzo przesadzone odcienie.
Przykład: Czerwone krwinki będą miały jaskrawoczerwony lub ciemnopomarańczowy kolor, chromatyna jądrowa będzie miała bladoróżowy kolor, a granulki eozynofili będą miały jaskrawoczerwony kolor.
Obecność osadów w rozmazie
Przyczynami mogą być:
- Używaj brudnych lub słabo wypranych prześcieradeł.
- Nie dopuść do całkowitego wyschnięcia plamy.
- Pozostaw roztwór utrwalający na dłuższy czas.
- Niewłaściwe mycie pod koniec farbowania.
- Niewłaściwa filtracja lub brak filtracji stosowanego barwnika.
Obecność artefaktów morfologicznych
W plamach mogą pojawić się artefakty morfologiczne, utrudniające wizualizację i interpretację struktur. Dzieje się tak, ponieważ:
- Rodzaj zastosowanego środka przeciwzakrzepowego, np. heparyna.
- Stosowanie liści brudnych, uszkodzonych lub tłustych.
Tryb przechowywania
Po przygotowaniu barwnik należy przechowywać w temperaturze pokojowej (15-25°C), aby zapobiec jego wytrącaniu. Przechowywać w szczelnie zamkniętym bursztynowym pojemniku.
Referencje
- Cannova D, Brito E i Simons M. Ocena technik barwienia w diagnostyce leiszmaniozy skórnej. Salus . 2016; 20 (2): 24-29.
- Odczynniki PanReac Applichem ITW. Barwienie Giemsy. Wersja 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Hiszpania.
- Clark G. Procedury barwienia (1981), 4. Williams & Willkins.
- Chemia kliniczna stosowana. Barwienie Giemsy w diagnostyce in vitro . Dystrybutor: cromakit.es
- Ramírez I, Mejía M, García de la Riva J, Hermes F i Grazioso C. Ważność barwienia metodą Giemsy i Lendruma w rozmazach spojówek w celu identyfikacji Chlamydiatrachomatis. Sanit Panam Bowl. 1994; 116 (3): 212–216.
- Casas-Rincón G. Mykologia ogólna. 1994. Wydanie 2. Centralny Uniwersytet Wenezueli, wydania biblioteczne. Wenezuela, Caracas
- Barwienie metodą Giemsy. Wikipedia, wolna encyklopedia 1 września 2017 r., godz. 01:02 UTC. 6 grudnia 2018 r., en.wikipedia.org.