Colorația Giemsa este o tehnică utilizată în microbiologie și citogenetică pentru colorarea celulelor și țesuturilor, permițând vizualizarea structurilor specifice. Dezvoltată de Gustav Giemsa în 1904, colorarea Giemsa este una dintre cele mai utilizate tehnici în laboratoarele de diagnostic pentru identificarea microorganismelor, paraziților și cromozomilor.
Colorarea cu Giemsa necesită materiale precum colorant Giemsa, metanol și apă distilată. Tehnica implică fixarea celulelor pe lame de sticlă, urmată de aplicarea colorantului Giemsa diluat în metanol. După colorare, celulele sunt spălate în apă distilată și observate la microscop.
Principalele utilizări ale colorării cu Giemsa includ identificarea agenților patogeni precum Plasmodium (care provoacă malaria), Trypanosoma (care provoacă boala Chagas) și bacterii precum Chlamydia și Rickettsia. În plus, colorarea cu Giemsa este utilizată pe scară largă în analiza cromozomilor pentru diagnosticarea bolilor genetice și identificarea anomaliilor cromozomiale.
Ghid pas cu pas pentru efectuarea eficientă a colorației Giemsa.
Colorația cu Giemsa este o tehnică esențială în laboratoarele de analiză clinică și cercetare științifică. Permite vizualizarea diferitelor structuri celulare, cum ar fi cromozomii, paraziții și bacteriile, prin colorarea specifică a componentelor acestora. În acest articol, vom explica pas cu pas cum se efectuează eficient colorarea cu Giemsa.
Pasul 1: Preparați o soluție de Giemsa, care poate fi achiziționată gata preparată sau preparată din pulbere. Soluția trebuie diluată în apă distilată în proporția recomandată de producător.
Pasul 2: Fixați proba pe o lamă de sticlă folosind căldură sau fixatori, cum ar fi alcoolul etilic. Asigurați-vă că proba este fixată în siguranță pentru a evita distorsiunea în timpul colorării.
Pasul 3: Acoperiți proba fixată cu soluție de Giemsa, asigurându-vă că întreaga suprafață este acoperită uniform. Lăsați lama în contact cu soluția pentru o perioadă specifică de timp, de obicei între 10 și 30 de minute.
Pasul 4: Clătiți lama sub jet de apă pentru a îndepărta excesul de pată. Uscați ușor lama cu hârtie absorbantă sau aer comprimat.
Pasul 5: Observați proba colorată la microscop optic folosind obiective de mărire adecvate. Colorația Giemsa va permite vizualizarea structurilor celulare cu o claritate și un contrast mai mare.
Colorația Giemsa este utilizată pe scară largă în diverse domenii ale biologiei și medicinei, cum ar fi diagnosticarea bolilor parazitare, analiza celulelor sanguine și identificarea agenților infecțioși. Urmând corect pașii descriși mai sus, se pot obține rezultate precise și fiabile ale colorației Giemsa.
Înțelegeți procesul de colorare Giemsa și cum funcționează în detaliu.
Colorația Giemsa este o metodă utilizată pe scară largă în laboratoarele de microbiologie și hematologie pentru vizualizarea structurilor celulare și detectarea agenților patogeni. Dezvoltată de Gustav Giemsa în 1902, această metodă se bazează pe afinitatea coloranților bazici și acizi pentru diferite componente celulare.
Materialele necesare pentru colorarea cu Giemsa includ colorantul Giemsa, soluțiile de fixare și decolorare, lamele, lamelele și un microscop. Colorantul Giemsa este un amestec de albastru de metilen, eozină și glicerină și este utilizat pentru colorarea structurilor nucleare și citoplasmatice ale celulelor.
Tehnica de colorare Giemsa implică fixarea celulelor pe o lamă, urmată de aplicarea colorantului Giemsa pentru o perioadă specificată de timp. După colorare, celulele sunt spălate cu apă distilată și decolorate pentru a îndepărta excesul de colorant. În final, lamele sunt uscate și observate la microscop.
Principalele utilizări ale colorării cu Giemsa includ identificarea paraziților transmiși prin sânge, cum ar fi Plasmodium spp., și diferențierea celulelor sanguine în frotiurile de sânge periferic. În plus, această metodă este utilizată pe scară largă în identificarea bacteriilor, virusurilor și a altor agenți patogeni în probele clinice.
Funcționarea sa se bazează pe afinitatea coloranților bazici și acizi cu diferite componente celulare, oferind imagini clare și detaliate la microscop.
Înțelegerea procedurii de anatomie patologică cu colorare Giemsa pentru analiza clinică.
Colorația Giemsa este o tehnică utilizată în patologia anatomică pentru analiza clinică a probelor de țesut. Dezvoltată de omul de știință german Gustav Giemsa, această colorare este utilizată pe scară largă datorită capacității sale de a evidenția diverse componente celulare, cum ar fi nucleii, cromozomii și paraziții.
Colorarea cu Giemsa necesită o serie de materiale, inclusiv colorant Giemsa, alcool metilat, soluție salină și lame de sticlă. Procedura implică fixarea probei în alcool metilat, aplicarea colorantului Giemsa și spălarea cu soluție salină. După colorare, probele sunt observate la microscop pentru analiză.
Colorația Giemsa este utilizată pe scară largă în laboratoarele de anatomie patologică pentru a identifica diverse patologii, cum ar fi infecțiile parazitare, leucemia și bolile autoimune. Tehnica permite analiza detaliată a structurilor celulare, facilitând diagnosticul clinic și monitorizarea tratamentului.
Utilizarea sa este esențială pentru diagnosticarea și tratarea diferitelor boli, ceea ce o face o tehnică indispensabilă pentru profesioniștii din domeniul sănătății.
Identificarea colorantului utilizat pentru colorarea unui frotiu de sânge.
Colorația Giemsa este o metodă obișnuită utilizată pentru a observa diferite tipuri de celule sanguine într-un frotiu de sânge. Principalul colorant utilizat în acest proces este Pata Giemsa, care este un amestec de albastru de metilen, eozină și azur B. Acest colorant este deosebit de eficient în colorarea structurilor precum nucleii celulari, cromozomii și incluziunile citoplasmatice.
Colorant Giemsa: fundație, materiale, tehnică și utilizări
O Pata Giemsa este un tip de colorare pentru probele clinice, bazat pe un amestec de coloranți acizi și bazici. Crearea sa a fost inspirată de lucrările lui Romanowsky, unde Gustav Giemsa, un chimist și bacteriolog german, a perfecționat-o prin adăugarea de glicerol pentru a stabiliza compușii.
Modificările aduse tehnicii originale a lui Romanowsky ne-au permis să îmbunătățim considerabil observațiile microscopice; prin urmare, tehnica a fost denumită colorare Giemsa.
Deoarece este o tehnică simplă, extrem de funcțională și economică, este utilizată în prezent pe scară largă în laboratorul clinic pentru frotiuri hematologice, probe de măduvă osoasă și secțiuni de țesut.
Tehnica de colorare Giemsa este foarte utilă pentru studiile citologice, deoarece permite observarea unor structuri celulare specifice. Această tehnică colorează citoplasmele, nucleii, nucleolii, vacuolele și granulele celulelor, putând distinge urme fine de cromatină.
În plus, pot fi detectate modificări semnificative ale dimensiunii, formei sau culorii nucleului, fiind posibilă vizualizarea pierderii relației nucleu-citoplasmă.
Pe de altă parte, permite identificarea celulelor imature din măduva osoasă și din sângele periferic, ceea ce este important pentru diagnosticarea bolilor grave, cum ar fi leucemia. De asemenea, permite detectarea hemoparaziților, a bacteriilor extracelulare și intracelulare, a fungilor și a altor agenți patogeni.
În citogenetică, este utilizată pe scară largă, deoarece este posibil să se studieze mitoza celulară.
Fond de ten Giemsa
Coloranții de tip Romanowsky utilizează un contrast între coloranții acizi și cei bazici pentru a colora structurile bazice, respectiv cele acide. După cum se poate observa, coloranții acizi au o afinitate pentru colorarea structurilor bazice și invers.
Colorantul bazic utilizat este albastrul de metilen și derivații săi oxidați (Azure A și Azure B), în timp ce colorantul acid este eozina.
Structurile acide ale celulelor sunt acizi nucleici, granule bazofile segmentate, printre altele, așa că sunt colorate cu albastru de metilen.
În același sens, structurile de bază ale celulelor sunt hemoglobina și unele granule, cum ar fi cele conținute în eozinofilele segmentate, printre altele; acestea vor fi colorate cu eozină.
Pe de altă parte, deoarece albastrul de metilen și albastrul ceresc sunt caracterizate ca și coloranți metacromatici, acestea pot oferi un ton variabil diferitelor structuri în funcție de sarcina polianionică pe care o posedă.
Așa se face că prin combinarea strategică a coloranților bazici și acizi se poate dezvolta un spectru larg de culori, conform caracteristicilor biochimice ale fiecărei structuri, variind de la nuanțe de albastru pal, albastru închis, liliac și violet în cazul structurilor acide.
Deși culoarea oferită de eozină este mai stabilă, aceasta generează culori între portocaliu-roșcat și somon.
materiale
Materiale pentru prepararea soluției stoc
Prepararea soluției stoc necesită cântărirea a 600 mg de colorant pulbere Giemsa, măsurarea a 500 ml de alcool metilic fără acetonă și 50 ml de glicerină neutră.
Metoda de preparare a soluției stoc
Puneți pudra de Giemsa cântărită într-un mojar. Dacă există cocoloașe, acestea trebuie pulverizate. Apoi, adăugați o cantitate considerabilă de glicerină măsurată și amestecați bine. Turnați amestecul rezultat într-o sticlă de culoarea chihlimbarului, foarte curată.
Glicerina rămasă se adaugă în mortar. Se amestecă din nou pentru a îndepărta orice colorant rămas care s-a lipit de pereții mortarului și apoi se toarnă în aceeași sticlă.
Sticla se acoperă și se transportă timp de 2 ore într-o baie de apă la 55°C. În timp ce se află în baia de apă, amestecul se amestecă ușor la fiecare jumătate de oră.
Amestecul este apoi lăsat să se răcească înainte de a adăuga alcoolul. O parte din alcoolul măsurat este adăugată mai întâi în mortar pentru a termina spălarea oricărui colorant rămas, apoi este adăugată în amestec împreună cu alcoolul rămas.
Acest preparat trebuie lăsat la maturat timp de cel puțin 2 săptămâni. Porțiunea utilizată în soluția-mamă trebuie filtrată.
Pentru a evita contaminarea preparatului, se recomandă transferarea porțiunii care va fi utilizată constant într-o sticlă mică de culoarea chihlimbarului, cu pipetă. Reumpleți de fiecare dată când reactivul se epuizează.
Materiale pentru prepararea soluției tampon
Pe de altă parte, o soluție tampon la pH 7,2 se prepară după cum urmează:
6,77 g fosfat de sodiu (anhidru) (cântărit NaHPO 4 ), 2,59 g de fosfat dihidrogen de potasiu (KH 2 PO 4 ) și apă distilată până la 1000 ml.
Prepararea finală a colorantului
Pentru a prepara soluția finală de colorare, se măsoară 2 ml din soluția stoc filtrată și se amestecă cu 6 ml din soluția tampon. Amestecul se agită agitat.
Un fapt relevant care trebuie luat în considerare este faptul că tehnicile de preparare a coloranților se pot schimba în funcție de instalația comercială.
Materiale suplimentare necesare pentru realizarea colorării
Pe lângă materialele descrise, trebuie să existe punți colorate, tricouri cu apă sau un tampon pentru spălat haine, cearșafuri cu obiecte sau huse, un cronometru pentru controlul timpului de colorare și sugativ al hârtiei sau un material care servește la uscare (tifon sau bumbac).
tehnică
Procesul de colorare
1) Înainte de colorare, proba trebuie întinsă pe o lamă curată.
Probele pot fi sânge, măduvă osoasă, secțiuni de țesut histologic sau probe cervico-vaginale. Se recomandă ca pastele să fie subțiri și lăsate să se usuce timp de 1 până la 2 ore înainte de colorare.
2) Pe un pod de colorat, toate frunzele colorate sunt așezate. Funcționează întotdeauna în aceeași ordine, iar fiecare frunză este clar etichetată.
3) Puneți câteva picături de alcool metilic 100% (metanol) pe frotiu și lăsați timp de 3 până la 5 minute pentru a fixa și deshidrata proba.
4) Aruncați metanolul prezent pe frunză și lăsați-o să se usuce la aer.
5) După ce s-a uscat, adăugați soluția finală de colorare cu o pipetă până când întreaga frunză este acoperită. Lăsați să acționeze timp de 15 minute. Unii autori recomandă până la 25 de minute. Depinde de magazin.
6) Scurgeți pata și spălați frotiul cu apă distilată sau o soluție tampon conform pasului 7.2.
7) Pe hârtie absorbantă, lăsați frunzele să se usuce la aer, aranjate vertical cu ajutorul unui suport.
8) Ștergeți spatele lamei cu o dischetă de tifon sau un bețișor de bumbac înmuiat în alcool pentru a îndepărta orice urmă de colorant.
Utilități
Tehnica de colorare Giemsa este utilizată în mai multe domenii, inclusiv: hematologie, micologie, bacteriologie, parazitologie, citologie și citogenetică.
Hematologie
Aceasta este cea mai frecventă utilizare a acestei colorații. Cu ajutorul ei, se poate identifica fiecare celulă prezentă în probele de măduvă osoasă sau de sânge periferic. Pe lângă estimarea numărului de celule din fiecare serie, se pot detecta leucocitoza sau leucopenia, trombocitopenia etc.
Deoarece este sensibil la identificarea celulelor imature, este util în diagnosticarea leucemiei acute sau cronice. De asemenea, poate diagnostica anemii precum anemia falciformă, printre altele.
Micologie
În această zonă, este obișnuit să se utilizeze Histoplasma capsulatum (ciupercă dimorfă intracelulară) în probe de țesut.
Bacteriologie
În frotiurile hematologice colorate cu Giemsa, este posibil să se detecteze Borrelia sp. la pacienții cu o boală numită febră recidivantă. Spirochetele se observă din abundență printre eritrocite în probele recoltate în momentul vârfului febrei.
De asemenea, este posibilă vizualizarea bacteriilor intracelulare ca Rickettsia sp. e Chlamydia trachomatis în celulele infectate.
Parazitologia
În domeniul parazitologiei, colorația Giemsa a permis diagnosticarea unor boli parazitare precum malaria, boala Chagas și leishmanioza.
În primii doi paraziți, Plasmodium sp e Trypanosoma cruzi, respectiv, pot fi observate în sângele periferic al pacienților infectați și pot fi găsite în diverse stadii, în funcție de stadiul bolii.
Pentru a îmbunătăți căutarea paraziților în sânge, se recomandă utilizarea colorantului Giemsa amestecat cu colorantul May-Grünwald.
În mod similar, leishmanioza cutanată poate fi diagnosticată prin evaluarea probelor de biopsie cutanată colorate cu Giemsa, acolo unde se găsește parazitul.
Citologia
Colorația Giemsa este utilizată și pentru studiul citologic al probelor endocervicale, deși nu este tehnica cea mai utilizată în acest scop.
Totuși, în cazurile de resurse insuficiente, poate fi utilizat, oferind o funcționalitate similară cu testul Papanicolau și la un cost mai mic. Necesită însă expertiza examinatorului.
Citogenetică
O caracteristică cheie a colorării Giemsa este capacitatea sa de a se lega puternic de regiunile ADN bogate în adenină și timină. Acest lucru permite vizualizarea ADN-ului în timpul mitozei celulare, în diferite stări de condensare.
Aceste studii sunt necesare pentru detectarea aberațiilor cromatice, cum ar fi duplicațiile, delețiile sau translocațiile diferitelor regiuni ale cromozomilor.
Cercetări care demonstrează eficacitatea colorării Giemsa
Cannova și colab. (2016) au comparat trei tehnici de colorare pentru diagnosticarea leishmaniozei cutanate.
În acest scop, au fost utilizate probe obținute de la un animal de experiment ( Mesocrisetus auratus) inoculate experimental cu Leishmanii.
Autorii au demonstrat că colorarea cu Giemsa a fost superioară colorării Pap-mart® și Gaffney. Prin urmare, au considerat că colorarea cu Giemsa este ideală pentru diagnosticarea leishmaniozei cutanate.
Rezultatele excelente obținute de autori se datorează faptului că combinația de coloranți care alcătuiesc amestecul Giemsa are condițiile necesare pentru a crea un contrast favorabil, făcând posibilă distingerea clară a structurilor amastigotelor, atât intra-, cât și extracelular.
Și celelalte tehnici (Pap-mart® și Gaffney) au realizat acest lucru, dar într-un mod mai slab și, prin urmare, mai dificil de vizualizat. De aceea, colorația Giemsa este recomandată pentru diagnosticul parazitologic al leishmaniozei.
În mod similar, un studiu realizat de Ramírez și colab. (1994) a evaluat validitatea colorațiilor Giemsa și Lendrum în frotiurile conjunctivale pentru identificarea Chlamydiatrachomatis.
Autorii au stabilit că colorațiile Giemsa și Ledrum au aceeași specificitate, dar Giemsa s-a dovedit a fi mai sensibilă.
Aceasta explică de ce colorația Giemsa este în prezent cea mai frecvent utilizată pentru diagnosticarea infecțiilor cu chlamidie, în special în mediile cu resurse limitate.
Recomandări pentru o colorare bună
Frunzele nu trebuie uscate prea repede. Ar trebui să așteptați timpul necesar pentru a le usca la aer. Aproximativ 2 ore.
Colorați imediat după 2 ore pentru cele mai bune rezultate.
Pentru ca petele să se fixeze și să se amestece mai bine, proba trebuie întinsă pe foaie într-un strat subțire și uniform.
Proba de sânge preferată este cea capilară, deoarece frotiul se prelevează direct din picătura de sânge și, prin urmare, proba nu conține aditivi, ceea ce favorizează menținerea structurilor celulare.
Totuși, dacă se utilizează sânge venos, EDTA trebuie utilizat ca anticoagulant și nu heparina, deoarece aceasta din urmă deformează de obicei celulele.
Greșeli frecvente în colorarea cu Giemsa
Când se folosește această tehnică de colorare, se pot face greșeli. Acestea sunt evidențiate de schimbări bruște ale nuanței structurii.
Culoare extrem de albastră
Se poate datora:
- Pete foarte groase
- Depășirea timpului de colorare
- Spălați insuficient.
- Utilizarea reactivilor la valori mult peste pH-ul neutru (alcalin).
În aceste condiții, culorile următoarelor structuri sunt distorsionate, astfel încât eritrocitele, în loc să se coloreze în roz-somon, vor deveni verzi, granulele de eozinofile, care ar trebui să fie vopsite în roșu-cărămiziu, vor deveni albăstrui sau gri și așa mai departe, o abatere de la nuanțele obișnuite.
Colorație excesiv de roz
Se poate datora:
- Timp de colorare insuficient.
- Spălare prelungită sau excesivă.
- Nu foarte uscat
- Utilizarea reactivilor foarte acizi.
În acest caz specific, structurile care sunt în mod normal nuanțate în albastru vor fi abia vizibile, în timp ce structurile care sunt nuanțate în roz vor avea nuanțe foarte exagerate.
Exemplu: Globulele roșii vor apărea în roșu aprins sau portocaliu intens, cromatina nucleară va apărea în roz pal, iar granulele de eozinofile se vor păta în roșu aprins.
Prezența precipitatelor în frotiu
Cauzele pot fi:
- Folosește cearșafuri murdare sau prost spălate.
- Nu lăsați pata să se usuce bine.
- Lăsați soluția de fixare pentru o perioadă lungă de timp.
- Spălare necorespunzătoare la sfârșitul colorării.
- Filtrare inadecvată sau nicio filtrare a colorantului utilizat.
Prezența artefactelor morfologice
În pete pot apărea artefacte morfologice, ceea ce face dificilă vizualizarea și interpretarea structurilor. Acest lucru se datorează faptului că:
- Tipul de anticoagulant utilizat, cum ar fi heparina.
- Utilizarea frunzelor murdare, deteriorate sau uleioase.
Mod de stocare
După preparare, colorantul trebuie păstrat la temperatura camerei (15-25°C) pentru a preveni precipitarea acestuia. Acesta trebuie depozitat într-un recipient de culoarea chihlimbarului, bine închis.
Referințe
- Cannova D, Brito E și Simons M. Evaluarea tehnicilor de colorare pentru diagnosticarea leishmaniozei cutanate. Salus . 2016; 20 (2): 24-29.
- Reactivi PanReac Applichem ITW. Colorarea Giemsa. Versiunea 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Spania.
- Clark G. Proceduri de colorare (1981), vol. a 4-a. Williams & Willkins.
- Chimie clinică aplicată. Colorație Giemsa pentru diagnostic in vitro Distribuitor: cromakit.es
- Ramírez I, Mejía M, García de la Riva J, Hermes F și Grazioso C. Validitatea colorațiilor Giemsa și Lendrum în frotiurile conjunctivale pentru identificarea Chlamydiatrachomatis. Bolul Sanit Panam. 1994; 116(3): 212-216.
- Casas-Rincón G. Micologie generală. 1994. Ed. a II-a. Universitatea Centrală din Venezuela, Edițiile Bibliotecii. Venezuela, Caracas
- «Colorație Giemsa.» Wikipedia, Enciclopedia Liberă 1 septembrie 2017, ora 01:02 UTC. 6 decembrie 2018, ro.wikipedia.org.