Giemsa barvanje je tehnika, ki se uporablja v mikrobiologiji in citogenetiki za barvanje celic in tkiv, kar omogoča vizualizacijo specifičnih struktur. Giemsa barvanje, ki ga je leta 1904 razvil Gustav Giemsa, je ena najpogosteje uporabljenih tehnik v diagnostičnih laboratorijih za identifikacijo mikroorganizmov, parazitov in kromosomov.
Giemsa barvanje zahteva materiale, kot so Giemsa barva, metanol in destilirana voda. Tehnika vključuje fiksiranje celic na steklena stekelca, ki mu sledi nanos Giemsa barve, razredčene v metanolu. Po barvanju se celice sperejo z destilirano vodo in opazujejo pod mikroskopom.
Giemsa barvanje se uporablja predvsem za identifikacijo patogenov, kot so plazmodij (ki povzroča malarijo), tripanosoma (ki povzroča Chagasovo bolezen), in bakterije, kot sta klamidija in rikecija. Poleg tega se Giemsa barvanje pogosto uporablja pri analizi kromosomov za diagnosticiranje genetskih bolezni in prepoznavanje kromosomskih nepravilnosti.
Navodila po korakih za učinkovito izvedbo barvanja po Giemsi.
Giemsa barvanje je bistvena tehnika v kliničnih analizah in znanstvenoraziskovalnih laboratorijih. Omogoča vizualizacijo različnih celičnih struktur, kot so kromosomi, paraziti in bakterije, s specifičnim barvanjem njihovih komponent. V tem članku bomo korak za korakom razložili, kako učinkovito izvesti Giemsa barvanje.
Korak 1: Pripravite Giemsa raztopino, ki jo lahko kupite že pripravljeno ali pa jo pripravite iz prahu. Raztopino je treba razredčiti v destilirani vodi v razmerju, ki ga priporoča proizvajalec.
Korak 2: Vzorec pritrdite na stekleno ploščico s toploto ali fiksativom, kot je etilni alkohol. Prepričajte se, da je vzorec varno pritrjen, da se med barvanjem ne popači.
Korak 3: Fiksirani vzorec prekrijte z Giemsa raztopino in pazite, da je celotna površina enakomerno prekrita. Stekelce pustite v stiku z raztopino določen čas, običajno med 10 in 30 minutami.
Korak 4: Stekelce sperite pod tekočo vodo, da odstranite odvečno barvo. Stekelce nežno posušite z vpojnim papirjem ali stisnjenim zrakom.
Korak 5: Obarvan vzorec opazujte pod svetlobnim mikroskopom z ustreznimi povečevalnimi objektivi. Giemsa barvanje bo omogočilo vizualizacijo celičnih struktur z večjo jasnostjo in kontrastom.
Barvanje po Giemsi se pogosto uporablja na različnih področjih biologije in medicine, kot so diagnosticiranje parazitskih bolezni, analiza krvnih celic in identifikacija povzročiteljev okužb. Z ustreznim sledenjem zgoraj opisanim korakom je mogoče dobiti natančne in zanesljive rezultate barvanja po Giemsi.
Podrobno razumite postopek barvanja po Giemsi in kako deluje.
Giemsa barvanje je metoda, ki se pogosto uporablja v mikrobioloških in hematoloških laboratorijih za vizualizacijo celičnih struktur in odkrivanje patogenov. To metodo je leta 1902 razvil Gustav Giemsa in temelji na afiniteti bazičnih in kislih barvil za različne celične komponente.
Materiali, potrebni za barvanje po Giemsi, vključujejo barvilo po Giemsi, raztopine za fiksiranje in razbarvanje, preparate, krovna stekelca in mikroskop. Barvilo po Giemsi je mešanica metilenskega modrega, eozina in glicerina ter se uporablja za barvanje jedrnih in citoplazemskih struktur celic.
Tehnika barvanja po Giemsi vključuje fiksiranje celic na preparat, ki mu sledi nanos barvila Giemsa za določen čas. Po barvanju se celice sperejo z destilirano vodo in razbarvajo, da se odstrani odvečno barvilo. Na koncu se preparati posušijo in opazujejo pod mikroskopom.
Giemsa barvanje se uporablja predvsem za identifikacijo krvno prenosljivih parazitov, kot so Plasmodium spp., in diferenciacijo krvnih celic v razmazih periferne krvi. Poleg tega se ta metoda pogosto uporablja pri identifikaciji bakterij, virusov in drugih patogenov v kliničnih vzorcih.
Njegovo delovanje temelji na afiniteti bazičnih in kislih barvil z različnimi celičnimi komponentami, kar zagotavlja jasne in podrobne slike pod mikroskopom.
Razumeti postopek patološke anatomije z Giemsinim barvanjem za klinično analizo.
Giemsa barvanje je tehnika, ki se uporablja v anatomski patologiji za klinično analizo vzorcev tkiva. Razvil jo je nemški znanstvenik Gustav Giemsa in se pogosto uporablja zaradi svoje sposobnosti, da osvetli različne celične komponente, kot so jedra, kromosomi in paraziti.
Giemsa barvanje zahteva številne materiale, vključno z Giemsa barvilom, metiliranim alkoholom, fiziološko raztopino in steklenimi ploščicami. Postopek vključuje fiksiranje vzorca v metiliranem alkoholu, nanos Giemsa barvila in izpiranje s fiziološko raztopino. Po barvanju se vzorci opazujejo pod mikroskopom za analizo.
Giemsa barvanje se pogosto uporablja v laboratorijih za anatomsko patologijo za identifikacijo različnih patologij, kot so parazitske okužbe, levkemija in avtoimunske bolezni. Tehnika omogoča podrobno analizo celičnih struktur, kar olajša klinično diagnozo in spremljanje zdravljenja.
Njegova uporaba je bistvena za diagnosticiranje in zdravljenje različnih bolezni, zaradi česar je nepogrešljiva tehnika za zdravstvene delavce.
Identifikacija barvila, uporabljenega za obarvanje krvnega razmaza.
Giemsa barvanje je pogosta metoda, ki se uporablja za opazovanje različnih vrst krvnih celic v krvnem razmazu. Glavno barvilo, ki se pri tem postopku uporablja, je Giemsa barvanje, ki je mešanica metilenskega modrega, eozina in azurnega B. To barvilo je še posebej učinkovito pri barvanju struktur, kot so celična jedra, kromosomi in citoplazemski vključki.
Giemsa barva: podlaga, materiali, tehnika in uporaba
O Giemsa barvanje je vrsta barvanja kliničnih vzorcev, ki temelji na mešanici kislih in bazičnih barvil. Njegov nastanek je navdihnilo delo Romanowskega, kjer ga je Gustav Giemsa, nemški kemik in bakteriolog, izpopolnil z dodatkom glicerola za stabilizacijo spojin.
Spremembe Romanowskega originalne tehnike so nam omogočile znatno izboljšanje mikroskopskih opazovanj; zato smo tehniko poimenovali Giemsa barvanje.
Ker gre za preprosto, zelo funkcionalno in ekonomično tehniko, se trenutno pogosto uporablja v kliničnem laboratoriju za hematološke razmaze, vzorce kostnega mozga in tkivne prereze.
Giemsa tehnika barvanja je zelo uporabna za citološke študije, saj omogoča opazovanje specifičnih celičnih struktur. Ta tehnika obarva citoplazme, jedra, nukleole, vakuole in granule celic, pri čemer lahko razloči drobne sledi kromatina.
Poleg tega je mogoče zaznati pomembne spremembe v velikosti, obliki ali barvi jedra, kjer je mogoče vizualizirati izgubo odnosa med jedrom in citoplazmo.
Po drugi strani pa omogoča identifikacijo nezrelih celic v kostnem mozgu in periferni krvi, kar je pomembno za diagnozo resnih bolezni, kot je levkemija. Omogoča tudi odkrivanje hemoparazitov, zunajceličnih in znotrajceličnih bakterij, gliv in drugih patogenov.
V citogenetiki se pogosto uporablja, saj je mogoče preučevati celično mitozo.
Giemsa podlaga za barvanje
Barvila tipa Romanowsky uporabljajo kontrast med kislimi in bazičnimi barvili za barvanje bazičnih oziroma kislih struktur. Kot je razvidno, imajo kisla barvila afiniteto za barvanje bazičnih struktur in obratno.
Osnovno barvilo, ki se uporablja, je metilensko modro in njegovi oksidirani derivati (Azure A in Azure B), kislo barvilo pa je eozin.
Kisle strukture celic so med drugim nukleinske kisline, segmentirane bazofilne granule, zato so obarvane z metilenskim modrim.
V istem smislu so osnovne strukture celic hemoglobin in nekatere granule, kot so tiste, ki jih vsebujejo segmentirani eozinofilci, med drugim; te bodo obarvane z eozinom.
Po drugi strani pa, ker sta metilensko modro in nebesno modro označena kot metakromatska barvila, lahko različnim strukturam dajeta spremenljiv ton glede na polianionski naboj, ki ga imata.
Tako lahko strateška kombinacija bazičnih in kislih barvil razvije širok spekter barv, glede na biokemične značilnosti posamezne strukture, od odtenkov bledo modre, temno modre, lila in vijolične v primeru kislih struktur.
Čeprav je barva, ki jo zagotavlja eozin, bolj stabilna, ustvarja barve med rdečkasto oranžno in lososovo.
Materiali
Materiali za pripravo osnovne raztopine
Za pripravo osnovne raztopine je treba stehtati 600 mg barvila Giemsa v prahu, odmeriti 500 ml metilnega alkohola brez acetona in 50 ml nevtralnega glicerina.
Metoda priprave osnovne raztopine
Stehtani Giemsa prašek stresite v terilnik. Če so kakšne grudice, jih je treba zdrobiti. Nato dodajte precejšnjo količino odmerjenega glicerina in dobro premešajte. Nastalo mešanico prelijte v zelo čisto jantarno steklenico.
Preostali glicerin dodamo v malto. Ponovno premešamo, da odstranimo morebitno preostalo barvilo, ki se je prilepilo na stene malte, nato pa jo vlijemo v isto steklenico.
Steklenico pokrijemo in jo 2 uri prevažamo v vodni kopeli pri 55 °C. Medtem ko je v vodni kopeli, mešanico rahlo premešamo vsake pol ure.
Mešanico nato pustimo, da se ohladi, preden dodamo alkohol. Najprej se v malto doda del odmerjenega alkohola, da se dokončno spere morebitno preostalo barvilo, nato pa se skupaj s preostalim alkoholom doda mešanici.
Ta pripravek je treba pustiti zoreti vsaj 2 tedna. Del, ki se uporabi v matični lužnici, je treba filtrirati.
Da bi se izognili kontaminaciji pripravka, je priporočljivo, da del, ki bo nenehno v uporabi, prenesete v majhno jantarno stekleničko s kapalko. Vsakič, ko je reagent porabljen, stekleničko napolnite.
Materiali za pripravo puferske raztopine
Po drugi strani pa se puferska raztopina s pH 7,2 pripravi na naslednji način:
6,77 g natrijevega fosfata (brezvodnega) (stehtano NaHPO 4 ), 2,59 g kalijevega dihidrogenfosfata (KH 2 PO 4 ) in destilirano vodo do 1000 ml.
Končna priprava barvila
Za pripravo končne raztopine za barvanje odmerite 2 ml filtrirane osnovne raztopine in jo zmešajte s 6 ml puferske raztopine. Zmes pretresite.
Pomembno dejstvo, ki ga je treba upoštevati, je, da se tehnike priprave barvil lahko razlikujejo glede na komercialno napravo.
Dodatni materiali, potrebni za barvanje
Poleg opisanih materialov morajo biti na voljo barvni mostovi, majice z vodo ali tampon za pranje perila, rjuhe s predmeti ali prevlekami, časovnik za nadzor časa barvanja in vpijanje papirja ali nekega materiala, ki služi za sušenje (gaza ali vata).
Tehnika
Postopek barvanja
1) Pred barvanjem je treba vzorec razmazati po čistem stekelcu.
Vzorci so lahko kri, kostni mozeg, histološki rezi tkiva ali vzorci materničnega vratu in vagine. Priporočljivo je, da so paste tanke in da se pred barvanjem sušijo 1 do 2 uri.
2) Na barvnem mostu so postavljeni vsi barvni listi. Vedno deluje v istem vrstnem redu in vsak list je jasno označen.
3) Na razmaz kanite nekaj kapljic 100 % metilnega alkohola (metanola) in pustite delovati 3 do 5 minut, da se vzorec fiksira in dehidrira.
4) Odstranite metanol, ki je bil prisoten na listu, in ga pustite, da se posuši na zraku.
5) Ko se posuši, s kapalko dodajte končno raztopino za barvanje, dokler ni prekrit celoten list. Pustite delovati 15 minut. Nekateri avtorji priporočajo do 25 minut. Odvisno od trgovine.
6) Odcedite madež in razmaz sperite z destilirano vodo ali pufersko raztopino v 7.2.
7) Na vpojnem papirju pustite liste, da se posušijo na zraku, razporejene navpično s pomočjo opore.
8) Zadnjo stran preparata obrišite z gazo ali vatirano palčko, namočeno v alkohol, da odstranite morebitno barvilo.
pripomočki
Giemsa tehnika barvanja se uporablja na več področjih, vključno z: hematologijo, mikologijo, bakteriologijo, parazitologijo, citologijo in citogenetiko.
Hematologija
To je najpogostejša uporaba tega barvila. Z njim je mogoče identificirati vsako celico, prisotno v vzorcih kostnega mozga ali periferne krvi. Poleg ocene števila celic v vsaki seriji lahko zazna tudi levkocitozo ali levkopenijo, trombocitopenijo itd.
Ker je občutljiv za prepoznavanje nezrelih celic, je uporaben pri diagnosticiranju akutne ali kronične levkemije. Z njim lahko diagnosticirate tudi anemije, kot je srpastocelična anemija, med drugim.
Mikologija
Na tem področju je pogosta uporaba Histoplasma capsulatum (znotrajcelične dimorfne glive) v vzorcih tkiva.
Bakteriologija
V hematoloških razmazih, obarvanih z Giemso, je mogoče odkriti Borrelije pri bolnikih z boleznijo, imenovano ponavljajoča se vročina. Spirohete so v vzorcih, odvzetih na vrhuncu vročine, v veliki količini opažene med eritrociti.
Možno je tudi vizualizirati znotrajcelične bakterije kot Rickettsia sp. e Chlamydia trachomatis v okuženih celicah.
Parazitologija
Na področju parazitologije je Giemsa barvanje omogočilo diagnozo parazitskih bolezni, kot so malarija, Chagasova bolezen in lišmanijaza.
Pri prvih dveh parazitih, Plasmodium sp e Trypanosoma cruzi, oziroma jih je mogoče opaziti v periferni krvi okuženih bolnikov in jih je mogoče najti v različnih fazah, odvisno od stadija bolezni.
Za izboljšanje iskanja parazitov v krvi je priporočljiva uporaba Giemsa barve, pomešane z May-Grünwaldovo barvo.
Podobno lahko kožno lišmaniozo diagnosticiramo z oceno vzorcev biopsije kože, obarvanih z Giemso, kjer se parazit nahaja.
Citologia
Giemsa barvanje se uporablja tudi za citološko študijo endocervikalnih vzorcev, čeprav ni najpogosteje uporabljena tehnika za ta namen.
Vendar pa se v primerih pomanjkanja virov lahko uporabi, saj ponuja podobno funkcionalnost kot Papa test in je cenejši. Vendar pa od zdravnika zahteva strokovno znanje.
Citogenetika
Ključna značilnost Giemsa barvanja je njegova sposobnost močne vezave na regije DNK, bogate z adeninom in timinom. To omogoča vizualizacijo DNK med celično mitozo, v različnih fazah kondenzacije.
Te študije so potrebne za odkrivanje kromatskih aberacij, kot so podvajanja, delecije ali translokacije različnih področij kromosomov.
Raziskave, ki dokazujejo učinkovitost Giemsa barvanja
Cannova in sodelavci (2016) so primerjali tri tehnike barvanja za diagnozo kožne lišmanioze.
V ta namen so bili uporabljeni vzorci, pridobljeni od poskusne živali ( Zlati mezokrisetus) eksperimentalno cepljeni z lišmanijo.
Avtorji so dokazali, da je Giemsa barvanje boljše od Pap-mart® in Gaffney barvanja. Zato so menili, da je Giemsa barvanje idealno za diagnosticiranje kožne lišmanioze.
Odlični rezultati, ki so jih dosegli avtorji, so posledica dejstva, da ima kombinacija barvil, ki sestavljajo Giemsa mešanico, potrebne pogoje za ustvarjanje ugodnega kontrasta, kar omogoča jasno razlikovanje struktur amastigotov, tako intra- kot ekstracelularno.
Tudi druge tehnike (Pap-mart® in Gaffney) so to omogočile, vendar na šibkejši način in zato težje za vizualizacijo. Zato se za parazitološko diagnozo lišmanioze priporoča barvanje po Giemsi.
Podobno je študija Ramíreza in sodelavcev (1994) ocenila veljavnost Giemsa in Lendrumovih barv v razmazih veznice za identifikacijo Klamidija trahomatis.
Avtorji so ugotovili, da imata Giemsa in Ledrum barvila enako specifičnost, vendar se je Giemsa izkazal za bolj občutljivega.
To pojasnjuje, zakaj se Giemsa barvanje trenutno najpogosteje uporablja za diagnozo klamidnih okužb, zlasti v okoljih z omejenimi viri.
Priporočila za dobro barvanje
Listov ne smete sušiti prehitro. Počakati morate ustrezno količino časa, da se posušijo na zraku. Približno 2 uri.
Za najboljše rezultate pobarvajte takoj po 2 urah.
Da se madeži bolje strdijo in zlijejo, je treba vzorec nanesti na rjuho v tanki, enakomerni plasti.
Prednostni vzorec krvi je kapilarni, saj se razmaz odvzame neposredno iz kapljice krvi in zato vzorec ne vsebuje nobenih dodatkov, kar spodbuja ohranjanje celičnih struktur.
Če pa se uporablja venska kri, je treba kot antikoagulant uporabiti EDTA in ne heparin, saj slednji običajno deformira celice.
Pogoste napake pri barvanju po Giemsi
Pri uporabi te tehnike barvanja lahko pride do napak. Te se kažejo v nenadnih spremembah odtenka strukture.
Izjemno modra obarvanost
Lahko je posledica:
- Zelo debele madeže
- Prekoračitev časa barvanja
- Ne umivajte dovolj.
- Uporaba reagentov precej nad nevtralnim (alkalnim) pH.
V teh pogojih se barve naslednjih struktur popačijo, tako da se eritrociti namesto lososovo rožnate barve obarvajo zeleno, eozinofilna zrnca, ki bi morala biti opečnato rdeča, pa postanejo modrikasta ali siva itd. odstopanje od običajnih odtenkov.
Pretirano rožnata obarvanost
Lahko je posledica:
- Premalo časa barvanja.
- Dolgotrajno ali pretirano pranje.
- Ni zelo suho
- Uporaba zelo kislih reagentov.
V tem konkretnem primeru bodo strukture, ki so običajno obarvane modro, komaj vidne, medtem ko bodo strukture, ki so obarvane rožnato, imele zelo pretirane odtenke.
Primer: Rdeče krvničke bodo videti svetlo rdeče ali temno oranžne, jedrni kromatin bo videti bledo rožnat, eozinofilne granule pa se bodo obarvale svetlo rdeče.
Prisotnost oborin v razmazu
Vzroki so lahko:
- Uporabljajte umazane ali slabo oprane rjuhe.
- Ne pustite, da se madež dobro posuši.
- Pustite raztopino za fiksiranje delovati dlje časa.
- Nepravilno pranje na koncu barvanja.
- Nezadostna filtracija ali odsotnost filtracije uporabljenega barvila.
Prisotnost morfoloških artefaktov
V madežih se lahko pojavijo morfološki artefakti, zaradi česar je težko vizualizirati in interpretirati strukture. To je zato, ker:
- Vrsta uporabljenega antikoagulanta, kot je heparin.
- Uporaba umazanih, poškodovanih ali mastnih listov.
Način shranjevanja
Po pripravi je treba barvilo hraniti pri sobni temperaturi (15–25 °C), da preprečimo njegovo obarjanje. Hranite ga v tesno zaprti jantarni posodi.
Literatura
- Cannova D, Brito E in Simons M. Vrednotenje tehnik barvanja za diagnozo kožne lišmanioze. Salus . 2016; 20 (2): 24-29.
- Reagenti PanReac Applichem ITW. Barvanje po Giemsi. Različica 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Španija.
- Clark G. Postopki barvanja (1981), 4. izdaja. Williams & Willkins.
- Uporabna klinična kemija. Giemsa barvanje za diagnostiko. in vitro Distributer: cromakit.es
- Ramírez I, Mejía M, García de la Riva J, Hermes F in Grazioso C. Veljavnost madežev Giemsa in Lendrum v razmazih veznice za identifikacijo Klamidija trahomatis. Skleda Sanit Panam. 1994; 116 (3): 212–216.
- Casas-Rincón G. Splošna mikologija. 1994. 2. izd. Centralna univerza Venezuele, knjižnične izdaje. Venezuela, Caracas
- "Giemsa barvanje." Wikipedija, prosta enciklopedija 1. september 2017 ob 01:02 UTC. 6. december 2018, en.wikipedia.org.