Microarrays de DNA: procedimento e aplicações

Um microarray de DNA , também chamado chip de DNA ou microarray de DNA, é composto por uma série de fragmentos de DNA ancorados a um suporte físico de material variável, plástico ou vidro. Cada pedaço de DNA representa uma sequência complementar a um gene específico.

O principal objetivo dos microarranjos é o estudo comparativo da expressão de certos genes de interesse.Por exemplo, é comum que essa técnica seja aplicada a duas amostras – uma em condições saudáveis ​​e outra patológica – para identificar quais genes estão sendo expressos e quais não estão na amostra que apresenta a condição. A referida amostra pode ser uma célula ou um tecido.

Microarrays de DNA: procedimento e aplicações 1

Por Paphrag na Wikipédia em inglês (transferido de en.wikipedia para o Commons.) [Domínio público], via Wikimedia Commons

Geralmente, a expressão gênica pode ser detectada e quantificada graças ao uso de moléculas fluorescentes. A manipulação de chips é realizada na maioria dos casos por robô e um grande número de genes pode ser analisado simultaneamente.

Essa nova tecnologia é útil para uma ampla gama de disciplinas, desde o diagnóstico médico até vários estudos de biologia molecular nos campos da proteômica e genômica.

Em que consiste?

Microarrays de DNA (ácido desoxirribonucleico) são um conjunto de segmentos específicos de DNA ligados a uma matriz sólida. Essas seqüências são complementares aos genes que desejam ser estudados e pode haver até 10.000 genes por cm 2 .

Essas características permitem o estudo sistemático e maciço da expressão gênica de um organismo.

As informações que uma célula precisa para sua operação são codificadas em unidades chamadas “genes”. Certos genes contêm instruções para a criação de moléculas biológicas essenciais chamadas proteínas.

Um gene é expresso se o seu DNA é transcrito para uma molécula intermediária de RNA mensageiro e a expressão do gene pode variar dependendo do nível de transcrição desse segmento de DNA. Em certos casos, a mudança na expressão pode ser indicativa de doenças.

O princípio da hibridação torna possível a operação de microarrays. O DNA é uma molécula composta por quatro tipos de nucleotídeos: adenina, timina, guanina e citosina.

Para formar a estrutura de dupla hélice, a adenina é agrupada com timina e a citosina com guanina. Assim, duas cadeias complementares podem ser ligadas por ligações de hidrogênio.

Tipos de microarrays

Quanto à estrutura dos microarranjos, existem duas variações: os compostos complementares de DNA ou oligonucleotídeo personalizados e os microarranjos comerciais de alta densidade fabricados por empresas comerciais, como a Affymetrix GeneChip.

O primeiro tipo de microarray permite a análise de RNA de duas amostras diferentes em um único chip, enquanto a segunda variação é do tipo comercial e possui um grande número de genes (por exemplo, o Affymetrix GeneChip possui cerca de 12.000 genes humanos), permitindo analisar Uma amostra

Procedimento

Isolamento de RNA

O primeiro passo na condução de um experimento usando a tecnologia de microarrays é o isolamento e a purificação de moléculas de RNA (pode ser o RNA mensageiro ou outros tipos de RNA).

Se você deseja comparar duas amostras (saudável versus doente, controle versus tratamento, entre outras), a molécula deve ser isolada nos dois tecidos.

Produção e rotulagem de CDNA

Posteriormente, o RNA é submetido a um processo de transcrição reversa na presença de nucleotídeos marcados e, assim, o DNA ou cDNA complementar será obtido.

A marcação pode ser fluorescente e deve ser diferenciável entre os dois tecidos a serem analisados. Tradicionalmente, os compostos fluorescentes Cy3 e Cy5 são usados, uma vez que emitem fluorescência em diferentes comprimentos de onda. No caso do Cy3, é uma cor próxima ao vermelho e o Cy5 corresponde ao espectro entre laranja e amarelo.

Hibridização

Os cDNAs são misturados e o microarray de DNA é incubado para permitir a hibridação (isto é, ocorre a ligação) do cDNA de ambas as amostras com a porção de DNA imobilizada na superfície sólida do microarray.

Uma porcentagem mais alta de hibridação com a sonda no microarray é interpretada como uma maior expressão tecidual do mRNA correspondente.

Leitura do sistema

A quantificação da expressão é realizada incorporando um sistema leitor que atribui um código de cores à quantidade de fluorescência emitida por cada cDNA. Por exemplo, se o vermelho for usado para marcar a condição patológica e esse híbrido em maior proporção, o componente vermelho será predominante.

Com esse sistema, você pode conhecer a superexpressão ou repressão de cada gene analisado nas duas condições selecionadas. Em outras palavras, o transcriptoma das amostras avaliadas no experimento pode ser conhecido.

Microarrays de DNA: procedimento e aplicações 2

Larssono [domínio público], do Wikimedia Commons

Aplicações

Atualmente, os microarrays são considerados ferramentas muito poderosas na área médica. Essa nova tecnologia permite o diagnóstico de doenças e uma melhor compreensão de como a expressão gênica é modificada sob diferentes condições médicas.

Além disso, permite a comparação de um tecido de controle e um tecido tratado com um determinado medicamento, a fim de estudar os efeitos de um possível tratamento médico.

Para fazer isso, são comparados o estado normal e o estado doente antes e após a administração do medicamento. Ao estudar o efeito da droga no genoma in vivo, há uma imagem melhor de seu mecanismo de ação. Além disso, pode-se entender por que alguns medicamentos específicos levam a efeitos colaterais indesejados.

Câncer

O câncer está no topo da lista de doenças estudadas com microarranjos de DNA. Essa metodologia tem sido utilizada para a classificação e prognóstico da doença, principalmente em casos de leucemia.

O campo de investigação dessa condição envolve a compressão e caracterização da base molecular das células cancerígenas para encontrar padrões de expressão gênica que resultam em falhas na regulação do ciclo celular e nos processos de morte celular (ou apoptose).

Outras doenças

Através do uso de microarranjos, foram elucidados perfis de expressão diferencial de genes em condições médicas de alergias, imunodeficiências primárias, doenças autoimunes (como artrite reumatoide) e doenças infecciosas.

Referências

  1. Bednar, M. (2000). Aplicação e tecnologia de DNA microarray. Monitor de Ciência Médica , 6 (4), MT796-MT800.
  2. Kurella, M., Hsiao, LL, Yoshida, T., Randall, JD, Chow, G., Sarang, SS, … & Gullans, SR (2001). Análise de microarray de DNA de processos biológicos complexos. Jornal da Sociedade Americana de Nefrologia , 12 (5), 1072-1078.
  3. Nguyen, DV, Bulak Arpat, A., Wang, N. e Carroll, RJ (2002). Experimentos de DNA com microarrays: aspectos biológicos e tecnológicos. Biometrics , 58 (4), 701-717.
  4. Plous, CV (2007). Microarrays de DNA e suas aplicações em pesquisa biomédica. Revista CENIC. Biological Sciences , 38 (2), 132-135.
  5. Wiltgen, M. & Tilz, GP (2007). Análise de microarrays de DNA: princípios e impacto clínico. Hematology , 12 (4), 271-287.

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