Teste de Voges-Proskauer: justificativa, preparação e usos

O teste de Voges-Proskauer é um teste bioquímico usado para ajudar a identificar bactérias pertencentes à família Enterobacteriaceae . Especialmente útil para diferenciar cepas de Escherichia coli de Klebsiella e Enterobacter , entre outras.

O teste é realizado no meio de cultura líquido chamado metil red – Voges Proskauer, mais conhecido com a sigla RM / VP. Este meio é composto de polipeptona tamponada, glicose, fosfato dipotássico e água destilada .

Teste de Voges-Proskauer: justificativa, preparação e usos 1

Vermelho Methyl-Voges Proskauer (RM / VP) / Teste positivo e negativo de VP, respectivamente. Fonte: Foto tirada pelo autor MSc. Marielsa Gil / Sudipta.nov15 [CC BY-SA 3.0 (https://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0)], do Wikimedia Commons

O atual meio RM / VP é uma modificação do meio Clark e Lubs, que originalmente continha uma menor concentração de peptonas e glicose. Portanto, menos íons hidrogênio foi produzido, necessário para a reação positiva de Voges-Proskauer.

O teste baseia-se na capacidade do microrganismo de usar glicose através da rota butileno-glicólica e formar um produto final neutro chamado acetoína, na presença de oxigênio e pH alcalino.

No meio RM / VP, além de poder revelar o teste de Voges-Proskauer, o teste do vermelho de metila também pode ser revelado.

Fundação

Base do teste de Voges-Proskauer

Os pluripeptons presentes no meio fornecem os requisitos nutricionais essenciais para o crescimento bacteriano. Por outro lado, a glicose é o principal composto. Muitas bactérias têm a capacidade de metabolizar glicose e formar ácido pirúvico.

O ácido pirúvico é um ponto médio no metabolismo da glicose e, a partir daí, cada microorganismo pode seguir caminhos diferentes. Alguns formarão ácidos mistos, como ácido lático, ácido acético, ácido fórmico e ácido succínico, e outros formarão produtos neutros, como o 2,3-butanodiol.

O teste de Voges-Proskauer revela a capacidade do microrganismo em formar acetilmetilcarbinol (acetoína), produto intermediário do 2,3-butanodiol em condições aeróbias.

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A acetoína é reduzida e forma 2,3-butanodiol, mas essa reação é reversível; portanto, se o 2,3-butanodiol for oxidado, a acetoína é formada. Portanto, o oxigênio é indispensável.

E de fosfato l de dipotássio é o tampão que amortece a mistura para pH 6,9 ± 0,2.

Base do desenvolvimento e interpretação do teste

Para demonstrar a reação, um desenvolvimento deve ser realizado usando dois reagentes (reagentes Barrit), conhecidos como Voges A e Voges B.

O Voges A é uma solução a 5% de α-naftol e o Voges B é uma preparação de hidróxido de potássio a 40%. Se o hidróxido de potássio não estiver disponível, ele poderá ser substituído por 40% de hidróxido de sódio.

O Nap-naftol é um catalisador que aumenta a intensidade da cor da reação, o que torna o teste mais sensível. O α-naftol sempre deve ser adicionado primeiro, agitando o tubo para que o meio entre em contato com o oxigênio. Deste modo, a acetoína presente é oxidada em diacetil e o 2,3-butanodiol é oxidado para formar acetoína, que é convertida em diacetil.

É assim que o α-naftol se liga ao diacetil, que por sua vez se une ao núcleo da guanidina presente no aminoácido arginina, este último proveniente de pluripeptonas.

Por sua vez, o hidróxido de potássio ou de sódio é responsável pela absorção de CO 2 e reagido com peptonas. Essa reação causa a formação de uma cor rosa-salmão, claramente visível após a agitação do tubo muito bem.

Para que a coloração ocorra instantaneamente, é necessário misturar quantidades corretas de diacetil, peptona e α-naftol. Se isso não acontecer, deixe o tubo repousar por 15 minutos antes de interpretar.

Geralmente o teste é positivo após 2 a 5 minutos, quando pode ser observada uma cor rosa fraca. Se for deixada em repouso por 30 minutos a 1 hora, a intensidade da cor será máxima (vermelho escuro).

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Um teste negativo será evidente quando o caldo estiver amarelo. Após 1 hora, se o teste for negativo, uma cor de cobre pode ser formada como resultado da reação do hidróxido de potássio no α-naftol.

Preparação

RM / VP médio

Pesar 17 g do meio de cultura desidratado e dissolver em um litro de água destilada. Deixe descansar por 5 minutos. Aqueça até ferver para dissolver completamente. Sirva de 3 a 4 ml em tubos e autoclave a 121 ° C por 15 minutos.

O meio de cultura desidratado é bege e o meio preparado é âmbar claro.

O pH final do meio é 6,9 ± 0,2.

Voges A reagente

Pesar 5 g de α-naftol e dissolver em 50 ml de álcool etílico (absoluto). Em seguida, continue adicionando álcool etílico para completar até 100 ml.

Reagente Voges B

Pesar 40 g de hidróxido de potássio e dissolver em 50 ml de água destilada em um copo. O vidro deve ser colocado em um banho de água fria para controlar a temperatura, porque no momento da dissolução a preparação aumenta acentuadamente.

Depois que a solução é fria, é transferida para um balão volumétrico e completada em 100 mL com água destilada.

Procedimento de teste Voges-Proskauer

Para realizar o teste de Voges-Proskauer, um caldo de RM / VP é inoculado com o microrganismo em estudo, de uma cultura pura de 18 a 24 horas.

O inóculo não deve ser muito denso. É incubado a 35-37 ° C por 24 a 48 horas, embora algumas vezes a incubação seja necessária por vários dias. Cowan e Steel acreditam que 5 dias é o tempo mínimo de incubação necessário para detectar todas as espécies positivas de Voges-Proskauer (VP) da família Enterobacteriaceae.

Desenvolvimento de teste

Separe uma alíquota de 1 mL em um tubo e execute o desenvolvimento da seguinte forma: coloque 12 gotas (0,6 mL) de reagente Voges A e 4 gotas (0,2 mL) de Voges B. Misture para arejar e deixe repousar por 5 a 10 minutos antes de executar. No entanto, se o teste ainda for negativo, deixe-o repousar e observe o tubo após 30 minutos a 1 hora.

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A aparência de uma cor vermelho-rosa indica que a reação de Voges-Proskauer é positiva. Se o meio ficar amarelo, a reação é negativa.

A adição dos desenvolvedores na ordem e quantidade indicadas é essencial para evitar falsos negativos.

Use

O teste de Voges-Proskauer é útil para diferenciar entre cepas de E. coli que são PV negativas, dos gêneros Klebsiella, Enterobacter, Serratia, entre outros, que são PV positivos.

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Fonte: Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnóstico microbiológico 5a ed. Editorial Panamericana SA Argentina.

Controle de qualidade

Para testar a qualidade do meio preparado, podem ser utilizadas cepas de controle, incluindo Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Proteus mirabilis ATCC 43071, Salmonella typhimurium e Enterobacter cloacae ATCC 13047.

Os resultados esperados são reações positivas de Voges-Proskauer apenas para K. pneumoniae e E. cloacae . O resto dá reações negativas.

Referências

  1. Laboratórios britânicos. MR-VP Medium. 2015. Disponível em: www.britanialab.com
  2. Laboratórios Microkit M-Ident Voges Proskauer. 2014. Disponível: http://www.medioscultivo.com
  3. Mac Faddin J. (2003). Testes bioquímicos para a identificação de bactérias de importância clínica. 3rd ed. Editora Panamericana. Bons ares. Argentina
  4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnóstico microbiológico de Bailey & Scott. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
  5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnóstico microbiológico 5a ed. Editorial Panamericana SA Argentina.

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