O ágar TCBS é um meio de cultura sólido e altamente selectivo diferencial, utilizados para o isolamento e cultivo de Vibrio, especialmente de Vibrio cholerae, V. vulnificus e V. parahaemolyticus como patogenes importantes deste tipo.
O acrônimo TCBS significa tiosulfato de citrato de sacarose biliar. Esse ágar também é conhecido como meio seletivo para Vibrios. A fórmula original foi criada por Nakanishi e posteriormente modificada por Kobayashi.
É composto de extrato de levedura, peptona de carne, triptein, citrato de sódio, tiossulfato de sódio, bile de boi, sacarose, cloreto de sódio, citrato férrico, azul de bromotimol, azul de timol e ágar.
Esta composição permite um desenvolvimento adequado das espécies de Vibrio a partir de amostras de água, alimentos e fezes; exceto Vibrio hollisae, que não cresce neste meio. Além disso, o meio TCBS é capaz de inibir o crescimento de outras bactérias acompanhantes, especialmente coliformes.
Devido aos sérios problemas gastrointestinais e extra-intestinais que algumas espécies do gênero Vibrio produzem, seu diagnóstico é muito importante. O ser humano é infectado principalmente pela ingestão de alimentos crus ou mal cozidos do mar ou de água contaminada, mas também por infecção de feridas.
Por esse motivo, os laboratórios clínicos devem incluir o ágar TCBS no estudo de co – culturas de amostras de fezes líquidas, especialmente com o aparecimento de água de arroz. Especialmente se o paciente relatar ter estado em contato com a água do mar ou ter consumido moluscos ou peixes.
Fundação
Extrato de levedura, peptonas de carne e triptein são a fonte nutricional deste meio. No entanto, o ágar TCBS é um meio inóspito para a maioria das bactérias.
Sua alta seletividade é dada pela adição de citrato de sódio e bile de boi; ambos são agentes inibidores que também fornecem pH alcalino ao meio, restringindo o crescimento da flora acompanhante e favorecendo o crescimento de V. cholerae, entre outras espécies. Note-se que o Vibrio cholerae é muito sensível à acidez.
Por outro lado, o cloreto de sódio se equilibra osmoticamente no meio. Além disso, como sua concentração é alta, também atua como um agente inibidor, favorecendo o crescimento de bactérias halofílicas.
A sacarose é o açúcar fermentável que, juntamente com os indicadores de pH do azul de bromotimol e azul de timol, conferem ao meio um caráter diferencial. Por esse motivo, com este meio é possível diferenciar as cepas fermentadoras de sacarose das não fermentativas.
As colônias das cepas de fermentação de sacarose desenvolvem-se em amarelo e tornam o meio verde a amarelo pela produção de ácidos. Os não fermentadores crescem translúcidos e o meio é a cor original (verde).
Da mesma forma, este meio contém tiossulfato de sódio como fonte de enxofre e citrato férrico como revelador. Ambos mostram as bactérias capazes de produzir sulfeto de hidrogênio (gás incolor). O H 2 S é formado a partir de tiossulfato e subsequentemente fazendo reagir com formação de precipitado de citrato férrico visíveis preto.
Finalmente, o ágar é o que fornece a consistência sólida ao meio.
Preparação
Pesar 89 g do meio desidratado e dissolver em um litro de água destilada. Ajude a dissolução por aquecimento e agitação frequente. A mistura pode ser fervida por até 2 minutos.
Este meio não autoclave. Após a dissolução, é servido diretamente em placas estéreis. Ao solidificar, eles são encomendados invertidos em plaquetas e armazenados em uma geladeira (2-8 ° C) até o uso.
O meio após a preparação deve estar em pH 8,6 ± 0,2.
A cor do meio desidratado é bege claro ou bege esverdeado, e a cor do meio é verde floresta ou verde-azulado.
É importante deixar as placas temperarem antes de semear as amostras.
Use
A amostra mais comum para o isolamento de Vibrios são as fezes diarreicas.
As amostras de fezes, se não puderem ser semeadas imediatamente no meio seletivo, devem ser transportadas no meio Cary Blair.
Para aumentar a sensibilidade da cultura, as fezes podem ser passadas através de água peptonada a pH 8,4 como meio de enriquecimento por um máximo de 8 horas, de onde são subcultivadas ao meio TCBS.
Também deve-se ter em mente que algumas cepas de Vibrios podem causar sepse em pacientes imunossuprimidos, para que possam ser isoladas de hemoculturas. Da mesma forma, amostras de água e alimentos do mar podem ser analisadas quando há surtos epidêmicos da doença da cólera.
Semeado
O inóculo da amostra em estudo deve ser proeminente, a semeadura é realizada pelo método de estriação por exaustão. As placas são incubadas a 37 ° C por 24 horas em aerobiose.
As colônias presuntivas de Vibrio cholerae são de tamanho médio, lisas, opacas, finas e de cor amarela porque fermentam sacarose.
Da mesma forma, as espécies de V. alginolyticus , V. fluvialis , V. hareyi, V. cincinnatiensis, V. furnissii, V. metschnikovii e alguns V. vulnificus crescem . Outras espécies de Vibrios clinicamente importantes, como V. parahaemolyticus , não fermentam sacarose, desenvolvendo-se como colônias de oliveiras.
Por outro lado, devemos ter em mente que algumas cepas de Aeromonas e Plesiomonas que são oxidase (+) podem crescer nesse meio, desenvolvendo colônias amarelas que podem confundir o clínico. Enquanto algumas cepas de Pseudomonas oxidase (+) também crescem como colônias verdes, assim como V. parahaemolyticus.
Limitação
O teste da oxidase positivo para o gênero Vibrio nunca deve ser realizado a partir de colônias obtidas do ágar TCBS, pois o resultado obtido será falso negativo. Os compostos do meio interferem fortemente neste teste. Portanto, deve ser feito a partir de subculturas em ágar sangue.
Controle de qualidade
Para provar que o meio está em boas condições, é aconselhável semear cepas de controle conhecidas ou certificadas e verificar se o crescimento atende às características esperadas.
Para isso, cepas de:
-Vibrio cholerae – crescimento satisfatório (colônias amarelas, borda translúcida).
-Vibrio parahaemolyticus ——– crescimento satisfatório (colônia com centro verde e borda translúcida).
-Vibrio alginolyticus ATCC 17749 – crescimento satisfatório (colônias amarelas com halos da mesma cor ao redor da colônia).
– Enterococcus faecalis ATCC 29212 – inibição total ou parcial (pequenas colônias amarelas ou translúcidas).
-Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 – inibição parcial ou total (colônias azuis).
-Escherichia coli ATCC 25922 – completamente inibida .
-Proteus mirabilis ATCC 43071 – Inibição total ou parcial. (Pequenas colônias verdes centram a borda translúcida).
A incubação de um meio sem inoculação não deve mudar.
Referências
- Laboratórios Difco Francisco Soria Melguizo. Ágar TCBS 2009. Disponível em: f-soria.es
- Laboratório BD. BD. TCBS Agar 2003. Disponível em: bd.com
- Laboratórios britânicos. TCBS Medium 2015. Disponível em: britanialab.com
- Laboratórios Acumedia. TCBS Agar. 2016. Disponível em: foodsafety.neogen.com
- Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnóstico microbiológico de Bailey & Scott. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
- Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnóstico microbiológico 5a ed. Editorial Panamericana SA Argentina.