Ágar de citrato de Simmons: justificativa, preparação e uso

O citrato de Simmons agar é um meio sólido usado como teste bioquímico microrganismos identificação negativos, especialmente bactérias Gram. O meio original foi criado por Koser em 1923.

O meio Citrato de Koser consistia em um caldo contendo fosfato de sódio, fosfato de amônio, fosfato monopotássico, sulfato de magnésio e citrato de sódio.

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A. Meio comercial demonstrado de Simmons Citrate Agar B. Simmons Citrate Agar preparado. Fonte: A. Foto tirada pelo MSc. Marielsa Gil B. Roto2esdios [CC BY-SA 3.0 (https://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0)], do Wikimedia Commons

Como pode ser visto, a única fonte de carbono no meio é o citrato, e o nitrogênio é o fosfato de amônio, omitindo proteínas e carboidratos como fonte desses elementos, geralmente presentes em outros meios.

Portanto, as bactérias inoculadas nesse meio só podem se reproduzir se forem capazes de absorver o carbono citrato. O teste foi positivo se houvesse turbidez no meio, porém tinha a desvantagem de que turbidez inespecífica pudesse ocorrer.

Este problema foi resolvido por Simmons adicionando ágar e azul de bromotimol à fórmula original de Koser. Embora o princípio seja o mesmo, ele é interpretado de maneira diferente.

Fundação

Algumas bactérias têm a capacidade de sobreviver na ausência de fermentação ou produção de ácido lático, necessitando obter energia através do uso de outros substratos. Neste teste, a única fonte de carbono oferecida é o citrato.

As bactérias capazes de sobreviver nessas condições metabolizam rapidamente o citrato por uma alternativa à via tradicional, usando o ciclo do ácido tricarboxílico ou o ciclo de fermentação do citrato.

O catabolismo do citrato pelas bactérias compreende um mecanismo enzimático sem a intervenção da coenzima A. Essa enzima é conhecida como citricase (citrato oxaloacetato liase) ou citrato desmolase. A reação requer a presença de um cátion bivalente, que nesse caso é fornecido por magnésio.

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A reação gera oxaloacetato e piruvato, que dão origem a ácidos orgânicos no meio de um pH alcalino formado pelo uso da fonte de nitrogênio. Esses ácidos orgânicos são utilizados como fonte de carbono, gerando carbonatos e bicarbonatos, alcalinizando ainda mais o meio.

Sementeira

O meio citrato de Simmons deve ser levemente inoculado no rabo de peixe usando ansa ou agulha reta e incubado por 24 horas a 35-37 ° C. Após o tempo, os resultados são observados.

A semeadura é feita apenas na superfície do ágar. Não perfure.

Interpretação

Se o meio permanecer na cor original (verde) e não houver crescimento visível, o teste será negativo, mas se o meio mudar para azul, indica a presença de produtos alcalinos, detectados pelo indicador de pH. Nesse caso, o teste é positivo.

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Citrato (+) e (-). Fonte: MSc. Marielsa Gil

Isso acontece porque, se a bactéria usa carbono citrato, ela também é capaz de extrair o nitrogênio do fosfato de amônio com o qual libera amônia, alcalinizando o meio.

Por outro lado, se o crescimento bacteriano for observado no meio, mas não houver alteração de cor, o teste também deverá ser considerado positivo, pois se houver crescimento, significa que a bactéria conseguiu usar o citrato como fonte de carbono, embora não haja alteração no pH no momento (às vezes pode demorar).

Se houver dúvida na interpretação da cor final, ela pode ser comparada com um tubo de citrato não inoculado.

Preparação

Pese 24,2 gramas do meio desidratado por um litro de água. Misture e deixe descansar por aproximadamente 5 minutos. Termine de dissolver o meio aquecendo por 1 ou dois minutos, mexendo sempre.

Servir 4 ml em tubos de ensaio e autoclave a 121 ° C por 15 minutos. Ao sair da autoclave, incline com a ajuda de um suporte, para que o ágar se solidifique na forma de um pico de flauta com pequeno bloco ou fundo e mais chanfro.

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O pH final do meio de citrato é 6,9 (cor verde). Este meio é muito sensível à mudança de pH.

No pH 6 ou abaixo, o meio fica amarelo. Esta cor não é observada no teste com bactérias.

E a pH 7,6 ou superior, o meio muda para intenso azul da Prússia.

Use

O ágar citrato Simmons é usado para a identificação de certos microorganismos, especialmente os bacilos pertencentes à família Enterobacteriaceae e outros bacilos de fermentação livres de glicose.

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Fonte: Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnóstico microbiológico 5a ed. Editorial Panamericana SA Argentina.

Considerações finais

O meio citrato de Simmons é um teste muito delicado, pois podem ser obtidos falsos positivos se forem cometidos certos erros.

Os cuidados que devem ser tomados são os seguintes:

Inoculum

Um inóculo bacteriano muito espesso ou carregado não deve ser feito, pois pode causar uma coloração amarela acobreada no local da semeadura, sem afetar o restante do meio, mas pode levar a acreditar que há crescimento. Isso não significa positividade do teste.

Da mesma forma, um inóculo espesso pode gerar um falso positivo, porque os compostos orgânicos pré-formados nas paredes celulares das bactérias moribundas podem liberar carbono e nitrogênio suficientes para ativar o indicador de pH.

Portanto, o ideal é semear usando a agulha em vez da alça de platina, para evitar o excesso de material.

Semeado

Por outro lado, quando a bateria de testes bioquímicos está sendo semeada para a identificação do microrganismo em questão, é importante que o teste de citrato seja o primeiro a ser inoculado, para evitar o arraste de proteínas ou carboidratos de outro meio.

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Nessas circunstâncias, é possível obter um falso positivo, pois qualquer uma dessas substâncias introduzidas por engano será metabolizada e causará uma alteração no pH.

Outra maneira de evitar o arrasto de substâncias é queimar bem o cabo e tomar um novo inóculo entre um teste e outro.

Também deve-se tomar cuidado ao tocar a colônia para realizar o inóculo, pois é necessário evitar arrastar parte do ágar da cultura de onde as bactérias provêm, devido ao explicado anteriormente.

Nesse sentido, Matsen, Sherris e Branson recomendam diluir o inóculo em solução fisiológica antes de inocular o teste de citrato para evitar a transferência de outras fontes de carbono.

Intensidade da cor

Note-se que a intensidade da cor produzida quando o teste é positivo pode variar de acordo com a casa comercial.

Além disso, existem microrganismos com resultado positivo em 24 horas, mas existem outras linhagens que requerem 48 horas ou mais para produzir uma alteração no pH.

Referências

  1. Mac Faddin J. (2003). Testes bioquímicos para a identificação de bactérias de importância clínica. 3rd ed. Editora Panamericana. Bons ares. Argentina
  2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnóstico microbiológico de Bailey & Scott. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
  3. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnóstico microbiológico 5a ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
  4. Laboratórios BD BBL Simmons Citrate Agar Slants. 2015. Disponível em: bd.com
  5. Laboratórios britânicos. Ágar de citrato de Simmons. 2015. Disponível em: britanialab.com
  6. Laboratórios de diagnóstico da Valtek. Ágar de citrato de Simmons. 2016. Disponível em: andinamedica.com.

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