Agar de conta padrão: justificativa, preparação e usos

O ágar-conta padrão é um meio de cultura sólido e não seletivo, projetado para a quantificação da carga microbiana aeróbia presente em amostras de água potável, esgoto, bebidas com leite, entre outros alimentos. Esse meio também é conhecido como ágar PCA, por seu acrônimo Plate Count Agar. Foi criado em 1953 por Buchbinder, Baris e Goldstein.

O meio de agar médio padrão é composto de extrato de levedura, trytein, glicose, ágar e água destilada . Esta formulação contém elementos nutricionais básicos que permitem o desenvolvimento da carga microbiana aeróbica presente, não exigente.

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Diluições decimais para a contagem de UFC em ágar de conta padrão. Fonte: Quentin Geissmann [CC BY-SA 3.0 (https://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0)]

Como o meio não contém inibidores, as bactérias podem se desenvolver sem restrições, sendo ideal para a contagem geral de colônias.No entanto, a técnica de quantificação de placas não detectará todas as bactérias presentes, mas apenas aquelas que são capazes de crescer sob as condições ambientais às quais o ágar-padrão semeado é submetido.

Nesse sentido, a técnica de quantificação de placas geralmente procura determinar a quantidade de bactérias mesofílicas aeróbicas, ou seja, aquelas que se desenvolvem a temperaturas entre 25 e 40 ° C, com uma temperatura ideal de crescimento a 37 ° C. .

Este grupo bacteriano é muito importante, porque a maioria das bactérias patogênicas para o homem é encontrada lá.

Deve-se notar que, às vezes, pode ser interessante quantificar a quantidade de bactérias psicrofílicas presentes nos alimentos. Essas bactérias são aquelas que se desenvolvem a baixas temperaturas (<20 ° C) e são responsáveis ​​pela quebra mais rápida dos alimentos, mesmo na geladeira.

Da mesma forma, bactérias termofílicas, que se desenvolvem entre 50 ° C e 80 ° C ou mais, podem ser importantes em certos tipos de alimentos, como alimentos enlatados.

A quantificação microbiana é expressa em unidades formadoras de colônias (UFC) por grama ou mililitro de amostra.

Fundação

O meio de contagem padrão é projetado para permitir o desenvolvimento satisfatório de bactérias aeróbicas não exigentes, uma vez que o extrato de levedura, triptein e glicose fornecem os nutrientes necessários para um bom desenvolvimento microbiano.

Por outro lado, o meio possui uma cor clara e uma aparência transparente, razão pela qual é ideal para visualizar colônias desenvolvidas pelo método de semeadura profunda (vazamento de placas).

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A contagem de colônias também é possível pelo método de semeadura de superfície com uma espátula de Drigalski.

Quando a carga microbiana é alta, devem ser feitas diluições decimais da amostra em estudo para poder contar a UFC.

Deve-se notar que este meio é recomendado pela Associação Americana de Saúde Pública (APHA) para contagem aeróbica de mesofílicos.

Preparação

Pesar 23,5 g do meio desidratado e dissolver em um litro de água destilada. Para dissolver completamente, a mistura deve ser aquecida mexendo sempre até ferver. As etapas a seguir dependem da técnica de semeadura a ser usada.

Para técnica de vazamento de placas

Distribua a distribuição de 12 a 15 ml em tubos de ensaio. Posteriormente, esterilize em autoclave a 121 ° C por 15 minutos. Deixe solidificar verticalmente na forma de um bloco. Guarde na geladeira até o uso.

Derreta o taco quando for usado. Depois de derretido, mantenha-o em banho-maria a 44-47 ° C enquanto prepara as amostras.

Para semeadura de superfície

Esterilize o meio em autoclave a 121 ° C e depois distribua 20 ml em placas de Petri estéreis. Deixe solidificar, inverter e guardar na geladeira até o uso.

Tempere as placas antes de usar. O pH do meio deve ser 7,0 ± 0,2.

Use

O ágar de contagem padrão é utilizado na técnica de contagem aeróbica mesofílica durante a análise microbiológica da água e dos alimentos. A contagem de mesófilos aeróbicos é necessária, pois determina a qualidade sanitária da amostra em estudo.

A aplicação desta técnica (usando este meio) permite a visualização macroscópica de colônias isoladas para quantificação.

Técnica de vazamento de placa (semeada em profundidade)

-Procedimento

A técnica consiste no seguinte:

1) Homogeneizar a amostra para redistribuir as bactérias presentes.

2) Uma suspensão inicial é feita em um frasco ou saco estéril, respeitando a razão 10 gr ou 10 ml de amostra em 90 ml de diluente (10 -1 ).

3) A partir da suspensão inicial, as diluições decimais relevantes são feitas dependendo do tipo de amostra. Ex: (10 -2 , 10 -3 , 10 -4 ). As diluições são feitas com água peptonada ou solução tampão de fosfato.

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Para fazer isso, 1 ml da suspensão inicial é tomado e colocado em 9 ml de diluente, continue as diluições, se necessário, agora tomando 1 ml da diluição 10-2 e assim por diante.

4) 1 ml de cada diluição é tomado e colocado em placas de Petri estéreis vazias.

5) Adicione a cada placa 12 a 15 ml de agar fundido padrão previamente derretido e repouse a 44-47 ° C.

6) Faça movimentos rotativos suaves nas placas para distribuir uniformemente a amostra ao lado do ágar e deixar solidificar.

7) Inverta as placas e incube a 37 ° C em aerobiose por 24 a 48 horas.

8) Após o tempo, as placas são examinadas e as colônias são contadas na diluição que permite. As placas com entre 30 e 300 UFC são escolhidas para contagem.

A contagem pode ser feita manualmente ou você pode usar o equipamento do contador de colônias.

Os valores permitidos por ml de amostra podem variar de um país para outro de acordo com as regras pelas quais são regidos.

Cálculo -UFC

O cálculo geral é feito usando a seguinte fórmula:

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Fórmula para o cálculo geral da quantificação da UFC. Fonte: Administração Nacional de Medicamentos Alimentares e Tecnologia Médica (ANMAT). Análise microbiológica de alimentos, metodologia analítica oficial, microrganismos indicadores. 2014 Volume 3. Disponível em: anmat.gov.ar

Expresse os resultados em 1 ou 2 dígitos, multiplicando pela base apropriada 10. Exemplo: se o resultado for 16.545, ele será arredondado com base no terceiro dígito para 17.000 e será expresso da seguinte forma: 1,7 x 10 4 . Agora, se o resultado for 16.436, ele será arredondado para 16.000 e 1,6 x 10 4 será expresso .

Técnica semeada na superfície

-Procedimento

– Inocule com 0,1 ml da amostra direta, se for líquido, suspensão inicial 10 -1 ou diluições consecutivas 10 -2 , 10 -3 etc., no centro de uma placa de ágar-conta padrão.

-Distribua a amostra uniformemente com uma espátula de Drigalski ou uma haste de vidro em forma de L. Deixe repousar por 10 minutos.

-Inverta as placas e incube na aerobiose a 37 ° C por 24 a 48 horas.

-Proceda para contar as colônias, escolha as placas que estão entre 20 e 250 UFC.

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Cálculo -UFC

Para o cálculo, é aplicado o fator de diluição, que é o inverso. O número é arredondado para 2 dígitos significativos (arredondamento de acordo com o terceiro dígito) e expresso em potência base 10. Por exemplo, se 224 CFUs são contadas na amostra não diluída (10 -1 ), 22 x 10 1 CFU são relatados , mas se o número fosse 225, 23 x 10 1 UFC é relatado.

No entanto, se 199 CFU forem contados na diluição de 10 -3 , 20 x 10 4 CFU serão relatados, mas se 153 CFU forem contados na mesma diluição, 15 x 10 4 CFU serão relatados.

Controle de qualidade

O meio de cultura de contagem padrão pode ser avaliado usando cepas conhecidas certificadas, como: Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Shigella flexneri ATCC 12022.

Se o meio de cultura estiver em ótimas condições, é esperado um crescimento satisfatório em todos os casos, com exceção de L. fermentum, que pode ter um rendimento regular.

Para avaliar a esterilidade do meio de cultura, uma ou duas placas de cada lote preparado (sem inoculação) devem ser incubadas a 37 ° C em aerobiose por 24 horas. Após esse período, nenhum crescimento ou mudança de cor do meio deve ser observado.

Limitações

-Não derreta o ágar mais de uma vez.

-O meio preparado pode durar até 3 meses, desde que seja mantido na geladeira e protegido da luz.

-Este meio não é adequado para microorganismos exigentes nem anaeróbios.

Referências

  1. Administração Nacional de Medicamentos Alimentares e Tecnologia Médica (ANMAT). Análise microbiológica de alimentos, metodologia analítica oficial, microrganismos indicadores. 2014 Volume 3. Disponível em: anmat.gov.ar
  2. Laboratorios Disco Francisco Soria Melguizo, SA Agar de contagem de placas. 2009. Disponível em: http://f-soria.es
  3. Laboratórios Conda Pronadisa. Ágar para métodos padrão (PCA) de acordo com APHA e ISO 4833. Disponível em: condalab.com
  4. Laboratórios britânicos. Contagem de placas de ágar. 2015. Disponível em: britanialab.com
  5. Camacho A, Giles M, Ortegón A, Palao M, Serrano B e Velázquez O. 2009. Técnicas de análise microbiológica de alimentos. 2nd ed. Faculdade de Química, UNAM. México Disponível em: depa.fquim.unam

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