Agar MRS: fundação, preparação e usos

O ágar MRS é uma cultura em meio sólido selectivo utilizado para o isolamento e enumeração de bactérias de ácido láctico, em especial o género Lactobacillus. Este ágar foi criado em 1960 por Man, Rogosa e Sharpe, com o mesmo nome, mas devido à sua complexidade, a abreviação MRS é frequentemente usada

É composto de peptona proteica, extrato de carne, extrato de levedura, glicose, monoleato de sorbitano, fosfato dipotássico, acetato de sódio, citrato de amônio, sulfato de magnésio, sulfato de manganês e ágar.

Agar MRS: fundação, preparação e usos 1

Agar Man Rogosa e Sharpe (MRS) plantados com Lactobacillus sp. Fonte: Foto doada para este artigo pelos autores: Báez E, González G, Hernández G, López E, Mega M. Foto tirada durante a pesquisa intitulada: Avaliação de bactérias do ácido láctico e Bifidobacteria com potencial probiótico no leite materno e nas fezes infantis .

Esta composição permite o bom desenvolvimento de bactérias do ácido lático a partir de amostras clínicas, como fezes, corrimento vaginal, amostras orais e leite materno, bem como alimentos lácteos e carnes.

Não é usado rotineiramente em laboratórios clínicos, porque as bactérias do ácido lático raramente estão envolvidas em processos patológicos. No entanto, na área da microbiologia alimentar, o uso de ágar MRS é mais frequente

Por outro lado, esse meio é utilizado por alguns Centros de Pesquisa, cujo objetivo é o estudo de bactérias do ácido lático.

Fundação

O ágar Man, Rogosa e Sharpe tem uma composição bastante complexa. Ao quebrar a função de cada um de seus componentes, sua lógica pode ser explicada.

Peptona protéica, extrato de carne, extrato de levedura e glicose são nutrientes que fornecem a fonte de carbono, nitrogênio, vitaminas e minerais necessários para o crescimento bacteriano. Além disso, a glicose é a fonte de energia universal usada na maioria dos meios de cultura.

Por outro lado, para favorecer o crescimento de bactérias do ácido láctico, é necessária a presença de cofatores essenciais (cátions) no metabolismo do Lactobacillus e bactérias relacionadas; Estes compostos são sais de sódio, magnésio e manganês.

Da mesma forma, o monoleato de sorbitano ou o polissorbato 80 são uma fonte importante de ácidos graxos quando absorvidos como nutrientes.

Além disso, o monoleato de sorbitano e o citrato de amônio atuam inibindo o desenvolvimento da flora associada, especialmente as bactérias Gram-negativas, proporcionando o caráter seletivo deste ágar.

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Finalmente, o ágar-ágar é o que confere consistência sólida ao meio.

Existem outras variantes do ágar Man Rogosa Sharpe; Um deles é a suplementação de cisteína (MRSc), muito útil para o isolamento de bifidobactérias, entre outros microorganismos. Por outro lado, existe o meio MRS suplementado com neomicina, paromomicina, ácido nalidíxico e cloreto de lítio, especialmente para a contagem seletiva de bifidobactérias em produtos lácteos.

Preparação

Pesar 68,25 gramas do meio desidratado e dissolver em um litro de água destilada. Deixe descansar por 5 minutos. Para dissolver completamente, leve a uma fonte de calor mexendo sempre e deixe ferver por 1 a 2 minutos. Esterilizar em autoclave a 121 ° C por 15 minutos.

Ao sair da autoclave, deixe repousar alguns minutos e distribua ainda quente em placas de Petri estéreis.

Deixe solidificar e inverter as placas, pedir as plaquetas e guardar na geladeira até o uso. Deixe as placas atingirem a temperatura ambiente antes de usá-las.

O pH do meio deve ser 6,4 ± 0,2. Algumas casas comerciais recomendam pH entre 5,5 e 5,9.

O meio desidratado é bege e preparado é âmbar escuro.

O meio desidratado e as placas preparadas devem ser armazenadas de 2 a 8 ° C.

Usos

As placas de ágar MRS podem ser semeadas na superfície (depleção ou com a espátula de Drigalski). Também pode ser semeado por profundidade. As placas devem ser incubados a 37 ° C em ambiente microaerofilico (4% de O 2 e 5-10% de CO 2 ) durante 24 a 72 horas.

O método de semeadura é escolhido de acordo com a finalidade pretendida (isolamento ou contagem).

Características da colônia

As colônias presuntivas de Lactobacillus crescem esbranquiçadas e apresentam uma aparência mucóide ou cremosa neste ágar. Posteriormente, eles devem ser identificados.

Isolamento de bactérias do ácido láctico

Para isso, a semeadura de superfície é usada. As amostras a serem semeadas requerem um procedimento anterior.

No caso de amostras de leite materno, recomenda-se centrifugar 1 ml da amostra a 14.000 rpm por 10 minutos, a fim de remover a camada gordurosa. São descartados 900 µl e, nos 100 µl restantes, o sedimento é suspenso e derramado sobre a superfície do ágar MRS, devendo então ser distribuído uniformemente com uma espátula de Drigalski.

No caso de amostras de fezes, um (1) grama de fezes é pesado e homogeneizado em 9 mL de água peptonada estéril a 0,1%, correspondendo a uma diluição de 1/10. Diluições seriadas são então feitas, até que seja obtida uma diluição final de 10 -4 .

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Finalmente, 100 μl das diluições 10 -2 , 10 -3 e 10 -4 são coletados e cada diluição é semeada em ágar MRS, distribuído uniformemente com uma espátula de Drigalski.

Contagem de bactérias do ácido láctico

Nesse caso, a semeadura é feita em profundidade.

Para amostras de leite materno, 1 mL é coletado e colocado em um tubo plástico cônico estéril. O ágar MRS é adicionado a uma temperatura aproximada de 40 ° C até um volume final de 25 mL, obtendo-se uma mistura homogênea. Em seguida, é vertida em placas de Petri estéreis uniformemente e deixada repousar até a polimerização.

Para amostras de fezes, são feitas diluições, conforme descrito acima. Toma-se 1 mL de cada diluição e coloca-se em tubos plásticos cônicos estéreis. O ágar MRS fundido é adicionado a um volume de 25 mL.

A mistura de cada diluição é vertida uniformemente em placas de Petri estéreis. Finalmente deixe repousar até a polimerização.

Agar MRS: fundação, preparação e usos 2

Contagem de colônias no ágar Man Rogosa e Sharpe (MRS). Fonte: Foto doada para este artigo. Autores: Báez E, González G, Hernández G, López E, Mega M. Foto tirada durante a pesquisa intitulada: Avaliação de bactérias do ácido láctico e Bifidobacteria com potencial probiótico no leite materno e nas fezes infantis.

No nível de pesquisa

O estudo das bactérias do ácido lático se torna cada vez mais interessante a cada dia; Especialmente os pesquisadores buscam conhecer novas cepas e seu potencial como fermento inicial para padronização na fabricação de laticínios, entre outros usos.

Nesse sentido, Alvarado et al. (2007) utilizaram o ágar MRS para realizar um estudo no qual isolaram, identificaram e caracterizaram as bactérias do ácido láctico presentes em um queijo venezuelano defumado andino tradicional.

No queijo, encontraram a presença de bactérias dos gêneros Lactococcus e Lactobacillus, e concluíram que misturas de cepas isoladas são adequadas como cepas iniciais na fabricação de queijos a partir de leite pasteurizado.

Por outro lado, Sánchez et al. (2017) utilizaram o ágar MRS para investigar a presença de bactérias do ácido lático no trato digestivo dos leitões, para usá-las como probióticos nativos que aumentam a produtividade de leitões saudáveis.

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Com isso, eles conseguiram isolar quatro espécies: Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus brevis, Enterococcus hirae e Pediococcus pentosaceus.

Da mesma forma, Báez et al. (2019) utilizaram o ágar MRS para avaliar as bactérias do ácido lático (LBA) e as bifidobactérias com potencial probiótico no leite materno e nas fezes infantis.

Eles conseguiram isolar 11 BAL e 3 Bifidobacteria sp no leite materno e 8 BAL e 2 Bifidobacteria sp . no banquinho Todos cumpriram certos parâmetros que os credenciam como bactérias com atividade probiótica.

Os autores concluíram que o leite materno e as fezes de bebês amamentados exclusivamente servem como fontes naturais de bactérias probióticas.

Controle de qualidade

Para avaliar a qualidade do ágar MRS, cepas de controle como:

Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Lactobacillus casei ATCC 393, Bifidobacterium bifidum ATCC 11863, Lactobacillus plantarum MKTA 8014, Lactobacillus lactis MKTA 19435, Pediococcus damnosus MKTA 29358, Escherichia cereus e Bacillus cereus .

Os resultados esperados são um crescimento satisfatório para as 6 primeiras bactérias, enquanto E. coli e Bacillus cereus devem ser completamente inibidos.

Referências

  1. Alvarado C, Chacón Z, Otoniel J, Guerrero B, López G. Isolamento, identificação e caracterização de bactérias do ácido láctico de um queijo venezuelano defumado artesão andino. Seu uso como uma colheita inicial. Cem (Maracaibo) 2007; 17 (3): 301-308. Disponível em: scielo.org.
  2. Sánchez H, Fabián F, Ochoa G, Alfaro Isolamento de bactérias do ácido láctico do trato digestivo do leitão. Rev. Invest. veterinário Peru 2017; 28 (3): 730-736. Disponível em: scielo.org.
  3. Báez E, González G, Hernández G, López E, Mega M. Avaliação de bactérias do ácido lático e bifidobactérias com potencial probiótico no leite materno e fezes infantis no município Acevedo, Miranda 2017. Trabalho de graduação para se qualificar para o Bacharelado em Bioanálise Universidade de Carabobo, Venezuela.
  4. Laboratório Britânico Ágar MRS 2015. Disponível em: britanialab.com
  5. Contribuidores da Wikipedia. Ágar MRS Wikipedia, A Enciclopédia Livre. 10 de janeiro de 2018 19:44 UTC. Disponível em: wikipedia.org Acesso em 17 de fevereiro de 2019.
  6. Roy D. Media para o isolamento e enumeração de bifidobactérias em produtos lácteos. Int J Food Microbiol, 200128; 69 (3): 167-82.

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