O Ágar Müeller Hinton é um meio de cultura utilizado em laboratórios para o cultivo de bactérias, especialmente aquelas que causam infecções. Foi desenvolvido por J. Müeller e J. Hinton na década de 1940, com o objetivo de fornecer um meio de cultura simples e eficiente para o teste de susceptibilidade antimicrobiana. Sua preparação envolve a mistura de ingredientes como peptona, amido e ágar, que são aquecidos e esterilizados antes de serem solidificados em placas de Petri. Este meio é amplamente utilizado em laboratórios clínicos e de microbiologia para testar a sensibilidade de bactérias a diversos antibióticos, auxiliando na escolha do tratamento mais adequado para infecções bacterianas.
Preparo do Ágar Mueller Hinton: passo a passo para uma cultura bacteriana eficaz.
O Ágar Müller Hinton é um meio de cultura amplamente utilizado em microbiologia para o cultivo e teste de sensibilidade de bactérias a antibióticos. Criado por Jane Hinton e John H. Mueller em 1941, este meio é especialmente formulado para garantir resultados precisos em testes de sensibilidade antimicrobiana.
Para preparar o Ágar Müller Hinton, siga os seguintes passos:
1. Prepare a solução de Ágar: Dissolva o pó de Ágar Müller Hinton em água destilada aquecida, mexendo bem até que esteja completamente dissolvido.
2. Ajuste o pH: Utilize ácido clorídrico ou hidróxido de sódio para ajustar o pH da solução para 7.2 a 7.4.
3. Autoclave a solução: Coloque a solução em frascos de vidro ou em placas de Petri e autoclave a 121°C por 15 minutos para esterilizar.
4. Prepare as placas de Ágar: Deixe as placas de Ágar Müller Hinton solidificarem em temperatura ambiente e, em seguida, armazene-as em geladeira até o momento de uso.
O Ágar Müller Hinton é amplamente utilizado em laboratórios para testar a sensibilidade de bactérias a antibióticos, ajudando os profissionais de saúde a escolher o tratamento mais eficaz para infecções bacterianas. Seguindo corretamente o processo de preparo, você garantirá uma cultura bacteriana eficaz e resultados confiáveis em seus testes de sensibilidade antimicrobiana.
Qual a importância do Ágar Mueller Hinton na microbiologia laboratorial?
O Ágar Mueller Hinton é um meio de cultura amplamente utilizado na microbiologia laboratorial, especialmente em testes de sensibilidade antimicrobiana. Fundado pelos microbiologistas John Howard Mueller e Jane Hinton em 1941, este meio possui características que o tornam ideal para determinar a eficácia de antibióticos contra bactérias.
A preparação do Ágar Mueller Hinton é feita a partir de uma combinação de ingredientes específicos, como amido, proteínas de caseína e agarose, que proporcionam um ambiente propício para o crescimento bacteriano. Além disso, a padronização do pH e da espessura do meio são fundamentais para garantir resultados precisos nos testes de sensibilidade.
Os usos do Ágar Mueller Hinton vão além dos testes de sensibilidade antimicrobiana. Este meio também é utilizado em pesquisas microbiológicas, na identificação de bactérias patogênicas e no controle de qualidade de produtos farmacêuticos e alimentos.
Em resumo, a importância do Ágar Mueller Hinton na microbiologia laboratorial reside na sua eficácia em avaliar a sensibilidade de bactérias aos antibióticos, na sua versatilidade de uso em diversos tipos de análises e na sua confiabilidade em fornecer resultados precisos e confiáveis.
Como é feito o antibiograma e qual o método utilizado para sua realização?
O antibiograma é um teste realizado em laboratório para determinar quais antibióticos são eficazes contra determinada bactéria. O método utilizado para sua realização é o uso do Ágar Müeller Hinton, um meio de cultura desenvolvido por John Hinton em 1941.
Para realizar o antibiograma, a bactéria é cultivada em placas de Ágar Müeller Hinton, onde são colocados discos de papel embebidos com diferentes antibióticos. Após a incubação, é possível observar em quais áreas houve crescimento bacteriano e em quais áreas houve inibição do crescimento, indicando a eficácia do antibiótico.
O Ágar Müeller Hinton é preparado a partir de uma combinação de ingredientes como proteínas, amido e sais minerais, que proporcionam as condições ideais para o crescimento das bactérias. Este meio de cultura é amplamente utilizado em laboratórios de microbiologia devido à sua eficácia e confiabilidade nos resultados.
Além do antibiograma, o Ágar Müeller Hinton também é utilizado em testes de sensibilidade de bactérias a antibióticos, permitindo aos médicos escolher o tratamento mais adequado para infecções bacterianas. Sua fundação por John Hinton revolucionou a microbiologia e continua sendo uma ferramenta essencial no combate às infecções bacterianas.
A relevância do meio Mueller Hinton na avaliação da sensibilidade aos antibióticos.
A avaliação da sensibilidade aos antibióticos é um processo crucial na medicina, que permite determinar quais medicamentos serão eficazes no tratamento de infecções bacterianas. O meio Mueller Hinton desempenha um papel fundamental nesse processo, fornecendo as condições ideais para o crescimento das bactérias e a ação dos antibióticos.
O Ágar Mueller Hinton possui uma composição específica que o torna ideal para testes de sensibilidade aos antibióticos. Sua baixa concentração de íons cálcio e magnésio permite que os antibióticos sejam eficazes contra as bactérias, sem interferências externas. Além disso, sua textura uniforme e capacidade de absorver os antibióticos de forma equilibrada garantem resultados precisos e confiáveis.
Por isso, o meio Mueller Hinton é amplamente utilizado em laboratórios de microbiologia para avaliar a sensibilidade das bactérias aos diferentes tipos de antibióticos. Os resultados obtidos nesse meio são essenciais para guiar os médicos na escolha do tratamento mais adequado para cada infecção, contribuindo para o sucesso do tratamento e evitando o desenvolvimento de resistência bacteriana.
Ágar Müeller Hinton: fundação, preparação e usos
O Hinton Agar Mueller é um não – meio nutriente sólido selectiva, o qual compreende a infusão de carne, peptona de casea ida, amido, ágar e água destilada . Este meio permite excelente desenvolvimento microbiano da maioria das bactérias de crescimento rápido.
Foi originalmente criado por John Howard Müeller e Jane Hinton para isolar bactérias nutricionalmente exigentes, como Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis.No entanto, devido às suas características, mostrou-se ideal para o estudo da suscetibilidade a antibióticos, fornecendo resultados confiáveis e reprodutíveis.
Portanto, o ágar Müeller Hinton é o meio de cultura aceito pelo Instituto de Padrões Clínicos e Laboratoriais (CLSI) e pelo Comitê Europeu de Testes de Susceptibilidade Antimicrobiana, para a execução do teste de suscetibilidade antimicrobiana pelo método de difusão em disco de Kirby e Bauer
Fundação
Sendo um meio nutritivo não seletivo, é excelente para o crescimento da maioria das bactérias patogênicas.
Por outro lado, sua composição simples faz com que as substâncias se difundam facilmente, sendo uma característica essencial para o teste de suscetibilidade pelo método de difusão em disco.
Outra de suas características é que ele contém uma baixa quantidade de inibidores, o que permite avaliar efetivamente as sulfonamidas, trimetoprim e tetraciclinas.
No entanto, deve-se ter em mente que o médium deve atender a certas condições para garantir seu bom funcionamento, incluindo:
O ajuste do pH, a profundidade do ágar e a concentração adequada de timina, timidina, Ca ++ , Mg ++ e Zn ++ .
Deve-se também saber que a metodologia é padronizada e, portanto, todos os parâmetros devem ser atendidos, como:
A concentração do inóculo, a concentração e preservação dos discos de antibióticos, a colocação do número apropriado de discos no ágar, a distância entre um disco e outro, a colocação estratégica de certos antibióticos, a atmosfera, a temperatura e o tempo de incubação
Preparação
Pesar 37 gr do meio Müeller Hinton seco e dissolver em 1 litro de água destilada. Aqueça o meio enquanto mexe para facilitar sua dissolução. Deixe ferver por 1 minuto.
Leve a autoclave para esterilizar a 121 ° C por 15 minutos. Ao remover da autoclave, a fiola deve ser colocada em banho-maria a 50 ° C para esfriar. Despeje 25 a 30 ml em placas de Petri estéreis com 10 cm de diâmetro.
As placas devem ter uma espessura média de 4 mm (ideal), sendo permitido um intervalo de 3-5 mm.
Se desejar preparar o ágar-sangue usando a base de ágar Müeller Hinton, é derramado sangue de cordeiro estéril e desfibrinado a 5% antes de servir nas placas.
O pH final do meio deve estar entre 7,2 e 7,4.
Invista e guarde na geladeira, até o uso. Deixe a placa atingir a temperatura ambiente antes de usar.
A cor do meio preparado é bege claro.
Usos
É utilizado para realizar o teste de antibiograma ou de sensibilidade a antibióticos para a maioria dos patógenos de crescimento rápido não exigentes.
Se o ágar for suplementado com sangue, ele serve para realizar o antibiograma de microrganismos exigentes, como: Streptococcus pneumoniae , Haemophilus sp, Neisseria meningitidis, entre outros.Também foi usado para isolar Legionella pneumophila .
Técnica de antibiograma
Antes de realizar o antibiograma, uma solução bacteriana equivalente a 1,5 x 108 células deve ser preparada .
Para fazer isso, 3 a 4 colônias da cultura pura são colhidas e suspensas em caldo de soja tripticase ou em caldo Müeller Hinton, incubadas por 2 a 6 horas e ajustam a concentração com solução salina estéril, comparando-a com o padrão de Mac Farland. 0,5%
Se eles estão exigindo microorganismos, as colônias podem ser suspensas diretamente até atingirem a concentração de 0,5% de Mac Farland.Posteriormente, a placa Müeller Hinton é semeada com um cotonete impregnado com a solução bacteriana preparada.
Para fazer isso, o swab é imerso na solução e, em seguida, o excesso de líquido é removido pressionando contra as paredes do tubo.Imediatamente depois, o cotonete é passado por toda a superfície, sem deixar locais intocados, depois a placa é girada levemente e semeada novamente. A operação é repetida mais 2 vezes.
Deixe repousar por 10 minutos e, em seguida, coloque os discos de antibióticos com uma pinça estéril, deixando um espaço de 24 mm entre eles.Depois de colocar cada disco no ágar, pressione levemente cada um com o grampo para garantir que estejam bem presos.
Após o processo, a placa é invertida e incubada a 35-37 ° C em aerobiose por 16 a 18 horas.Se for um microrganismo exigente, pode merecer microaerofilia e, se o antibiograma contiver discos de oxacilina, deve ser lido dentro de 24 horas.
Uma régua é usada para medir o diâmetro de cada halo. Os resultados devem ser anotados em mm. Posteriormente, os valores obtidos são correlacionados com as tabelas de corte publicadas pelo manual atual do CLSI.
Relate como sensível (S), intermediário (I) ou resistente (R), conforme o caso.
Os antibióticos são selecionados de acordo com o microorganismo isolado e o tipo de infecção que está produzindo.
Ocasionalmente, a colocação estratégica de antibióticos deve ser levada em consideração para mostrar padrões de resistência fenotípica.
Colocação estratégica de discos no ágar Müeller Hinton
Para enterobactérias, o disco de ácido clavulânico deve ser colocado contra as cefalosporinas de terceira e quarta geração. Um alargamento em forma de ovo indica que a cepa é produtora de betalactamases de espectro estendido (ESBL). Isso significa que o paciente não deve ser tratado com nenhuma cefalosporina.
No Staphylococcus, é importante colocar o disco de eritromicina ou azitromicina na frente do disco de clindamicina (teste D).
Um halo resistente à eritromicina e um achatamento do halo da clindamicina indicam que a cepa tem uma resistência induzível à clindamicina, cepa (RIC).Isso significa que um tratamento com clindamicina não será eficaz.
Para a pesquisa de cepas induzíveis de AMP C em enterobactérias e em alguns bacilos Gram-negativos não fermentativos, os discos de ceftazidima, cefoxitina ou piperacilina-tazobactana são expostos na frente de um disco imipenem, a uma distância de 27 mm.
Um halo achatado em um dos discos voltados para o imipenem indica a presença de AMP C. induzível
Para a busca pelo AMP C constitutivo, um disco de 500 µg de cloxacilina com ceftazidima (30 µg) e cefotaxima (30 µg) é colocado a uma distância de 25 mm. Um halo alargado em uma das cefalosporinas indica positividade.
O disco de cloxacilina também pode ser substituído por um disco de 9 mm de papel de filtro Whatman No. 6 impregnado com ácido fenil bórico (400 µg) com uma distância de 18 mm. É interpretado da mesma forma que o anterior.
Finalmente, para investigar a produção de metalobetalactamases, especialmente em Pseudomonas aeruginosa , é utilizado um disco impregnado com 10 µl de ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA 750 µg) e ácido tioglicólico (SMA 300 µg), que é confrontado com os discos imipenem e meropenem, a uma distância de 15 mm.
O teste é positivo se houver ampliação dos halos imipenem ou meropenem em direção ao disco EDTA / SMA.Este resultado deve ser confirmado pelo teste de Hodge modificado.
Este método consiste em inocular uma cepa de Escherichia coli ATCC 25922 na placa Müeller Hinton. Um disco imipenem é colocado no centro da placa e, em seguida, é feita uma ranhura do disco para a periferia com a cepa suspeita de P. aeruginosa . Até 4 deformações podem ser testadas por placa.
O teste será positivo se houver uma zona de distorção do halo imipenem ao redor da estria.
Causas de resultados errôneos
– Discos antibióticos mal preservados podem causar falsa resistência. Por exemplo, o disco de oxacilina é muito vulnerável a mudanças de temperatura.
-Um pH do meio abaixo do indicado (ácido) produz halos menores nos aminoglicosídeos e macrólidos (risco de falsa resistência) e halos maiores na penicilina, tetraciclina e novobiocina (risco de falsa sensibilidade).
-Se o pH estiver acima do indicado (alcalino), os efeitos descritos acima serão revertidos.
-Os meios com altas concentrações de timina e timidina influenciam significativamente a redução dos halos de inibição de sulfonamidas e trimetoprim.
-Altas concentrações de cálcio e magnésio produzem falsa resistência a aminoglicosídeos, polimixina B e tetraciclinas contra cepas de Pseudomonas aeruginosa .
– Baixas concentrações de cálcio e magnésio produzem falsas sensibilidades de aminoglicosídeos, polimixina B e tetraciclinas contra cepas de Pseudomonas aeruginosa .
-A presença de zinco afeta os resultados dos discos de carbapenem (imipenem, meropenem e ertapenem).
-A espessura do meio abaixo de 3 mm produz resultados falsos de sensibilidade, enquanto uma espessura acima de 5 produz falsa resistência.
-A mobilização de discos no antibiograma dará halos deformados, pois o download de antibióticos é imediato.
– Inóculos muito fracos afetam os resultados, pois não haverá crescimento uniforme ou confluente no ágar, condição necessária para medir os halos de inibição, além dos quais os halos podem dar maior que o normal.
-Inoculares muito carregados podem gerar halos menores que o normal.
-Não respeitar a distância entre os discos faz uma sobreposição de halo com outra e não pode ser lido corretamente.
-Incubar com CO 2 aumenta o tamanho dos halos dos discos de tetraciclina e meticilina.
-Incubar a temperaturas abaixo de 35 ° C produz halos maiores.
-A adição de sangue diminui o tamanho do halo dos medicamentos sulfa.
Limitação
A sensibilidade de um antibiótico demonstrado no antibiograma contra um microorganismo ( in vitro ) não garante que ele funcione in vivo .
Controle de qualidade
Para saber se o meio contém a quantidade adequada de timina, uma cepa de Enterococcus faecalis ATCC 29212 deve ser semeada e a susceptibilidade ao trimetoprim sulfametoxazol (SXT) testada, deve fornecer um halo igual ou> 20 mm para ser satisfatório.
Referências
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