Ágar Müeller Hinton: fundação, preparação e usos

O Hinton Agar Mueller é um não – meio nutriente sólido selectiva, o qual compreende a infusão de carne, peptona de casea ida, amido, ágar e água destilada . Este meio permite excelente desenvolvimento microbiano da maioria das bactérias de crescimento rápido.

Foi originalmente criado por John Howard Müeller e Jane Hinton para isolar bactérias nutricionalmente exigentes, como Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis.No entanto, devido às suas características, mostrou-se ideal para o estudo da suscetibilidade a antibióticos, fornecendo resultados confiáveis ​​e reprodutíveis.

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Antibiogramas (ágar Müeller Hinton). Fonte: Dr. Graham Beards em en.wikipedia

Portanto, o ágar Müeller Hinton é o meio de cultura aceito pelo Instituto de Padrões Clínicos e Laboratoriais (CLSI) e pelo Comitê Europeu de Testes de Susceptibilidade Antimicrobiana, para a execução do teste de suscetibilidade antimicrobiana pelo método de difusão em disco de Kirby e Bauer

Fundação

Sendo um meio nutritivo não seletivo, é excelente para o crescimento da maioria das bactérias patogênicas.

Por outro lado, sua composição simples faz com que as substâncias se difundam facilmente, sendo uma característica essencial para o teste de suscetibilidade pelo método de difusão em disco.

Outra de suas características é que ele contém uma baixa quantidade de inibidores, o que permite avaliar efetivamente as sulfonamidas, trimetoprim e tetraciclinas.

No entanto, deve-se ter em mente que o médium deve atender a certas condições para garantir seu bom funcionamento, incluindo:

O ajuste do pH, a profundidade do ágar e a concentração adequada de timina, timidina, Ca ++ , Mg ++ e Zn ++ .

Deve-se também saber que a metodologia é padronizada e, portanto, todos os parâmetros devem ser atendidos, como:

A concentração do inóculo, a concentração e preservação dos discos de antibióticos, a colocação do número apropriado de discos no ágar, a distância entre um disco e outro, a colocação estratégica de certos antibióticos, a atmosfera, a temperatura e o tempo de incubação

Preparação

Pesar 37 gr do meio Müeller Hinton seco e dissolver em 1 litro de água destilada. Aqueça o meio enquanto mexe para facilitar sua dissolução. Deixe ferver por 1 minuto.

Leve a autoclave para esterilizar a 121 ° C por 15 minutos. Ao remover da autoclave, a fiola deve ser colocada em banho-maria a 50 ° C para esfriar. Despeje 25 a 30 ml em placas de Petri estéreis com 10 cm de diâmetro.

As placas devem ter uma espessura média de 4 mm (ideal), sendo permitido um intervalo de 3-5 mm.

Se desejar preparar o ágar-sangue usando a base de ágar Müeller Hinton, é derramado sangue de cordeiro estéril e desfibrinado a 5% antes de servir nas placas.

O pH final do meio deve estar entre 7,2 e 7,4.

Invista e guarde na geladeira, até o uso. Deixe a placa atingir a temperatura ambiente antes de usar.

A cor do meio preparado é bege claro.

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Usos

É utilizado para realizar o teste de antibiograma ou de sensibilidade a antibióticos para a maioria dos patógenos de crescimento rápido não exigentes.

Se o ágar for suplementado com sangue, ele serve para realizar o antibiograma de microrganismos exigentes, como: Streptococcus pneumoniae , Haemophilus sp, Neisseria meningitidis, entre outros.Também foi usado para isolar Legionella pneumophila .

Técnica de antibiograma

Antes de realizar o antibiograma, uma solução bacteriana equivalente a 1,5 x 108 células deve ser preparada .

Para fazer isso, 3 a 4 colônias da cultura pura são colhidas e suspensas em caldo de soja tripticase ou em caldo Müeller Hinton, incubadas por 2 a 6 horas e ajustam a concentração com solução salina estéril, comparando-a com o padrão de Mac Farland. 0,5%

Se eles estão exigindo microorganismos, as colônias podem ser suspensas diretamente até atingirem a concentração de 0,5% de Mac Farland.Posteriormente, a placa Müeller Hinton é semeada com um cotonete impregnado com a solução bacteriana preparada.

Para fazer isso, o swab é imerso na solução e, em seguida, o excesso de líquido é removido pressionando contra as paredes do tubo.Imediatamente depois, o cotonete é passado por toda a superfície, sem deixar locais intocados, depois a placa é girada levemente e semeada novamente. A operação é repetida mais 2 vezes.

Deixe repousar por 10 minutos e, em seguida, coloque os discos de antibióticos com uma pinça estéril, deixando um espaço de 24 mm entre eles.Depois de colocar cada disco no ágar, pressione levemente cada um com o grampo para garantir que estejam bem presos.

Após o processo, a placa é invertida e incubada a 35-37 ° C em aerobiose por 16 a 18 horas.Se for um microrganismo exigente, pode merecer microaerofilia e, se o antibiograma contiver discos de oxacilina, deve ser lido dentro de 24 horas.

Uma régua é usada para medir o diâmetro de cada halo. Os resultados devem ser anotados em mm. Posteriormente, os valores obtidos são correlacionados com as tabelas de corte publicadas pelo manual atual do CLSI.

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Medição da inibição do halo. Fonte: USCDCP, Pixnio.com

Relate como sensível (S), intermediário (I) ou resistente (R), conforme o caso.

Os antibióticos são selecionados de acordo com o microorganismo isolado e o tipo de infecção que está produzindo.

Ocasionalmente, a colocação estratégica de antibióticos deve ser levada em consideração para mostrar padrões de resistência fenotípica.

Colocação estratégica de discos no ágar Müeller Hinton

Para enterobactérias, o disco de ácido clavulânico deve ser colocado contra as cefalosporinas de terceira e quarta geração. Um alargamento em forma de ovo indica que a cepa é produtora de betalactamases de espectro estendido (ESBL). Isso significa que o paciente não deve ser tratado com nenhuma cefalosporina.

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Expressão fenotípica da produção de betalactamases de espectro estendido (ESBL) em uma cepa de Escherichia coli. Fonte: Foto tirada pelo autor MSc. Marielsa Gil
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No Staphylococcus, é importante colocar o disco de eritromicina ou azitromicina na frente do disco de clindamicina (teste D).

Um halo resistente à eritromicina e um achatamento do halo da clindamicina indicam que a cepa tem uma resistência induzível à clindamicina, cepa (RIC).Isso significa que um tratamento com clindamicina não será eficaz.

Para a pesquisa de cepas induzíveis de AMP C em enterobactérias e em alguns bacilos Gram-negativos não fermentativos, os discos de ceftazidima, cefoxitina ou piperacilina-tazobactana são expostos na frente de um disco imipenem, a uma distância de 27 mm.

Um halo achatado em um dos discos voltados para o imipenem indica a presença de AMP C. induzível

Para a busca pelo AMP C constitutivo, um disco de 500 µg de cloxacilina com ceftazidima (30 µg) e cefotaxima (30 µg) é colocado a uma distância de 25 mm. Um halo alargado em uma das cefalosporinas indica positividade.

O disco de cloxacilina também pode ser substituído por um disco de 9 mm de papel de filtro Whatman No. 6 impregnado com ácido fenil bórico (400 µg) com uma distância de 18 mm. É interpretado da mesma forma que o anterior.

Finalmente, para investigar a produção de metalobetalactamases, especialmente em Pseudomonas aeruginosa , é utilizado um disco impregnado com 10 µl de ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA 750 µg) e ácido tioglicólico (SMA 300 µg), que é confrontado com os discos imipenem e meropenem, a uma distância de 15 mm.

O teste é positivo se houver ampliação dos halos imipenem ou meropenem em direção ao disco EDTA / SMA.Este resultado deve ser confirmado pelo teste de Hodge modificado.

Este método consiste em inocular uma cepa de Escherichia coli ATCC 25922 na placa Müeller Hinton. Um disco imipenem é colocado no centro da placa e, em seguida, é feita uma ranhura do disco para a periferia com a cepa suspeita de P. aeruginosa . Até 4 deformações podem ser testadas por placa.

O teste será positivo se houver uma zona de distorção do halo imipenem ao redor da estria.

Causas de resultados errôneos

– Discos antibióticos mal preservados podem causar falsa resistência. Por exemplo, o disco de oxacilina é muito vulnerável a mudanças de temperatura.

-Um pH do meio abaixo do indicado (ácido) produz halos menores nos aminoglicosídeos e macrólidos (risco de falsa resistência) e halos maiores na penicilina, tetraciclina e novobiocina (risco de falsa sensibilidade).

-Se o pH estiver acima do indicado (alcalino), os efeitos descritos acima serão revertidos.

-Os meios com altas concentrações de timina e timidina influenciam significativamente a redução dos halos de inibição de sulfonamidas e trimetoprim.

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-Altas concentrações de cálcio e magnésio produzem falsa resistência a aminoglicosídeos, polimixina B e tetraciclinas contra cepas de Pseudomonas aeruginosa .

– Baixas concentrações de cálcio e magnésio produzem falsas sensibilidades de aminoglicosídeos, polimixina B e tetraciclinas contra cepas de Pseudomonas aeruginosa .

-A presença de zinco afeta os resultados dos discos de carbapenem (imipenem, meropenem e ertapenem).

-A espessura do meio abaixo de 3 mm produz resultados falsos de sensibilidade, enquanto uma espessura acima de 5 produz falsa resistência.

-A mobilização de discos no antibiograma dará halos deformados, pois o download de antibióticos é imediato.

– Inóculos muito fracos afetam os resultados, pois não haverá crescimento uniforme ou confluente no ágar, condição necessária para medir os halos de inibição, além dos quais os halos podem dar maior que o normal.

-Inoculares muito carregados podem gerar halos menores que o normal.

-Não respeitar a distância entre os discos faz uma sobreposição de halo com outra e não pode ser lido corretamente.

-Incubar com CO 2 aumenta o tamanho dos halos dos discos de tetraciclina e meticilina.

-Incubar a temperaturas abaixo de 35 ° C produz halos maiores.

-A adição de sangue diminui o tamanho do halo dos medicamentos sulfa.

Limitação

A sensibilidade de um antibiótico demonstrado no antibiograma contra um microorganismo ( in vitro ) não garante que ele funcione in vivo .

Controle de qualidade

Para saber se o meio contém a quantidade adequada de timina, uma cepa de Enterococcus faecalis ATCC 29212 deve ser semeada e a susceptibilidade ao trimetoprim sulfametoxazol (SXT) testada, deve fornecer um halo igual ou> 20 mm para ser satisfatório.

Referências

  1. «Agar Müller-Hinton.» Wikipedia, A enciclopédia livre . 16 Nov 2018, 12:23 UTC. 27 Jan 2019, 04:22 <https://es.wikipedia.org
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  4. Disco Francisco Soria Melguizo Laboratory. Ágar Müeller Hinton com 5% de sangue de ovelha. 2009. Disponível em: http://f-soria.es
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