Agar Papa dextrose: fundação, preparação e uso

O ágar de dextrose de batata é um sólido nutriente não selectivo meio de cultura. Pode cultivar espécies bacterianas e fúngicas, mas seu uso é especialmente indicado para o isolamento de fungos filamentosos e leveduras. Também é conhecido como meio PDA para a expressão em inglês Potato Dextrose Agar.

É particularmente útil para o isolamento de fungos fitopatogênicos, ou seja, aqueles que afetam os vegetais. Outros meios, como o ágar Sabouraud ou o maltagar, podem ser utilizados para semear amostras de vegetais infectados ; no entanto, o ágar papa dextrose é preferido para uso rotineiro, pois é obtida uma maior esporulação.

Agar Papa dextrose: fundação, preparação e uso 1

Aspergillus niger e Sinemas em ágar papa dextrose, respectivamente. Fonte: Alextrevelian 006 na Wikipedia em inglês [Domínio público] / Joselrojas [CC BY-SA 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0)]

Também é usado para a contagem de colônias de fungos em amostras de cosméticos, produtos farmacêuticos e alguns laticínios. Da mesma forma, é adequado para semear amostras de raspados na pele em busca de dermatófitos, que crescem muito bem nesse ambiente, desenvolvendo seus pigmentos característicos.

O meio de dextrose de batata é um meio muito simples e fácil de preparar em laboratório. Contém, como o nome indica, infusão de batatas, dextrose e ágar-ágar. Além disso, substâncias inibitórias podem ser adicionadas para impedir o crescimento bacteriano e aumentar a seletividade para espécies fúngicas.

Fundação

O ágar Papa dextrose é um meio de cultura que fornece os elementos nutricionais necessários para o desenvolvimento de fungos filamentosos e leveduras.

A combinação de infusão de batata com glicose fornece a fonte de energia perfeita para um crescimento satisfatório de fungos. Enquanto o ágar é quem dá consistência ao meio ambiente.

O meio por si só não inibe o crescimento de bactérias , portanto, é um meio não seletivo. Para torná-lo seletivo, você precisa da adição de substâncias inibidoras, como ácido tartárico ou antibióticos.

Preparação

– Preparação caseira (não comercial) de ágar papa dextrose

Placas de Petri

É preparado da seguinte forma:

Primeiro, as batatas são lavadas muito bem removendo o solo que possuem. Eles são cortados em fatias finas com tudo e casca. 200 gramas de batata são pesados ​​e fervidos em um litro de água destilada por meia hora.

Uma vez terminado o tempo, toda a preparação é filtrada ou filtrada através de gaze.

O líquido obtido é completado com água destilada até atingir um litro. À infusão, 20 gramas de ágar-ágar e 20 gramas de dextrose são adicionados, bem misturados e autoclavados a 121 ° C, a 15 libras de pressão por 15 minutos.

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Deixe esfriar a 50 ° C e sirva em placas de Petri estéreis. Os pratos preparados são armazenados em uma geladeira.

Cunhas

Também podem ser preparadas fatias de agar de dextrose de batata.

Nesse caso, antes da esterilização na autoclave, 12 a 15 ml do meio são colocados em tubos, então eles são autoclavados e, quando saem, ficam em suportes especiais até solidificar. Guarde na geladeira

O meio está em um pH de 5,6 ± 0,2; no entanto, alguns laboratórios adicionam 10% de ácido tartárico para diminuir o pH para 3,1 ± 0,1, a fim de inibir o crescimento bacteriano.

Na mesma linha, outros laboratórios preferem adicionar antibióticos para torná-lo seletivo para a cultura de fungos e impedir o desenvolvimento bacteriano.

– Preparação comercial de ágar papa dextrose

Pesar 39 g do meio desidratado disponível no mercado e dissolver em um litro de água destilada. Deixe descansar por 5 minutos.

A mistura é aquecida por agitação frequente até completamente dissolvida. É posteriormente esterilizado em autoclave a 121 ° C por 15 minutos.

Você pode preparar pratos ou fatias. Proceda como descrito acima.

O pH é 5,6 ± 0,2. Se desejado, o pH de 3,1 deve ser adicionado 14 ml de ácido tartárico estéril a 20% antes de servir nas placas.

A cor do meio despreparado é bege e é âmbar claro, com uma aparência ligeiramente turva ou opalescente.

Usos

Processo para o plantio de amostras de plantas em ágar papa dextrose

-Para folhas manchadas

As folhas são cortadas em pedaços.

Em um copo de 50 cm3 com álcool a 50%, coloque os pedaços de folhas (manchados e saudáveis), para desinfetar a superfície por 20 a 30 segundos. Jogue fora o álcool e adicione 20% de hipoclorito de sódio por 40 a 50 segundos se forem folhas finas e aumente o tempo para 80 segundos se for casca e toras.

Descarte o hipoclorito de sódio e leve as brocas desinfetadas com um grampo estéril e coloque-as na superfície do meio (no máximo 10 peças). Defina a data e incube entre 20 e 30 ° C.

-Para frutas e tubérculos

Se a fruta for carnuda, abra a fruta afetada pelo fungo e retire os pedaços com um bisturi estéril, tanto da parte doente quanto da parte saudável, e coloque-a na superfície do ágar.

Se a fruta é cítrica, como limão ou laranja, suas sementes devem ser abertas e semeadas.

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Quando a superfície da fruta é afetada e os esporos são observados, o ideal é usar o método de ralar no prato; Isso consiste em tocar os esporos com uma espátula esterilizada e resfriada em forma de “L” e depois zig-zag semear 2 a 3 vezes no ágar.

-Para grãos

Eles são desinfetados conforme descrito nas folhas e subsequentemente colocados no ágar.

-Para galhos e hastes

A casca é raspada e, subsequentemente, pedaços da parte saudável e doente são retirados e plantados diretamente no ágar.

As placas semeadas são incubadas em aerobiose a 20-30 ° C por 72 horas.

Processo para semear amostras de escamas de pele, cabelo ou unhas no ágar papa dextrose

A amostra deve ser colhida com uma lâmina de bisturi nº 11, para cortar cabelos afetados, escamas de pele ou unhas para dermatófitos. Antes de coletar a amostra, a área deve ser desinfetada com álcool a 70%.

Amostra de pele

Nas lesões escamosas, a borda da lesão deve ser raspada, porque é mais provável encontrar o fungo.

Nas lesões exsudativas, a amostra é coletada com swab seco ou úmido. Semeie imediatamente em ágar papa dextrose ou em ágar Sabouraud. Evite meios de transporte.

Outro método de amostragem é através da técnica do tapete quadrado de Mariat e Adan Campos. Nesse caso, a área afetada é esfregada 5 vezes com um pedaço de lã estéril para cultivo posterior.

A amostra pode ser colocada diretamente no meio de cultura.

-Amostra de cabelo

Dependendo da patologia, a parte afetada pode ser cortada ou arrancada. Coloque a amostra no meio de cultura.

Amostra -Unha

Você pode raspar ou cortar uma parte específica da unha afetada. Vai depender do tipo de lesão.

Corte a amostra em pedaços de 1 mm antes da semeadura, a fim de aumentar a probabilidade de contato do fungo com o meio de cultura.

Procedimento de identificação

As colônias obtidas na placa são isoladas em tubos que contêm ágar papa dextrose para realizar o estudo macroscópico das colônias (aparência, cor, consistência, grau de desenvolvimento).

O estudo microscópico (observação de estruturas e suas formações) pode ser realizado por microculturas ou observação microscópica direta entre folhas e lamelas.

Contagem de colônias

Este meio também pode ser usado para determinar a carga de fungos e leveduras presente em amostras de plantas, alimentos, cosméticos ou medicamentos. Para esse fim, é utilizado o ágar papa dextrose suplementado com antibióticos, como: (cloranfenicol, clorotetraciclina ou ambos).

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Despeje 1 ml da amostra – de preferência diluída – em uma placa de Petri estéril e vazia, depois derreta um ágar de batata com taco dextrose e deixe esfriar a 45 ° C. Despeje sobre a placa de Petri e gire até homogeneizar. Deixe repousar até solidificar.

Incubar na aerobiose a 20-25 ° C (moldes) ou 30-32 ° C (leveduras) por 5 a 7 dias ou mais, dependendo do tipo de fungo que você está procurando e do tipo de amostra. Duas placas podem ser usadas para incubar em ambas as faixas de temperatura.

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Contagem de colônias de fungos em uma amostra de alimentos. Agar de dextrose de batata suplementado com antibióticos. Fonte: Pxhere.com photo / 777267

Manutenção de linhagens de fungos

O ágar Papa dextrose pode ser usado para manter viáveis ​​as linhagens de fungos por vários anos.

Para isso, o fungo é cultivado em fatias de ágar papa dextrose e, depois que o fungo cresce, é coberto com óleo mineral. O óleo deve ser esterilizado em autoclave por 45 minutos e ter uma viscosidade aproximada de 300 a 330 Saybolt. O óleo deve exceder a ponta do chanfro de 1 a 2 cm.

Controle de qualidade

Devem ser retiradas 1 ou 2 placas de cada lote preparado e incubadas a 25 ° C por 48 horas ou a 20 ° C por 96 horas. Um bom controle de esterilidade é aquele em que o desenvolvimento de colônias não é observado.

Cepas de controle conhecidas ou certificadas, como:

Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763, Candida albicans ATCC 10231, Aspergillus brasiliensis ATCC 16404, Trichophyton mentagrophytes ATCC 9533. Em todos os casos, é esperado um bom crescimento.

Referências

  1. Laboratórios britânicos. Batata-ágar de glicose. 2015. Disponível em: britanialab.com
  2. Laboratórios Neogen Agar de Dextrose de batata. Disponível em: foodsafety.neogen.com
  3. Laboratório Insumolab Agar de batata com dextrose. Disponível em: insumolab.cl
  4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnóstico microbiológico de Bailey & Scott. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
  5. Casas-Rincón G. Micologia Geral. 1994. 2ª Ed. Universidade Central da Venezuela, edições da Biblioteca. Venezuela, Caracas
  6. Olive M. Avaliação da Qualidade Microbiológica em Sombra para os Olhos, Tipo de Pó Compacto de um Laboratório Nacional de Produção, de acordo com o Método de Referência Pharmacopea Usp 2005. Tese para qualificar-se para o título de Farmacêutico. Universidade de San Carlos da Guatemala.
  7. Cuétara M. Processamento de amostras de superfície. Revista Ibero-Americana de Micologia. 2007; pp. 1-12

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