Caldo de tetrationato: justificativa, preparação e usos

O caldo de tetrationato ou caldo TT é um meio de cultura líquido selectivo para o enriquecimento e recuperação de isolados de Salmonella. Foi criado por Müeller e posteriormente modificado por Kauffmann, então há quem o chame de caldo de Müeller-Kauffmann.

O meio original continha peptonas protéicas, carbonato de cálcio e tiossulfato de sódio. Kauffmann adicionou sais biliares e criou outra modalidade com verde brilhante . Essas substâncias inibem o crescimento de coliformes, deixando o meio livre para o desenvolvimento de bactérias patogênicas, neste caso a Salmonella.

Caldo de tetrationato: justificativa, preparação e usos 1

Agregado da solução de iodo ao caldo de tetrationato. Fonte: Manuel Almagro Rivas [CC BY-SA 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0)]

A modificação teve muito sucesso porque aumentou significativamente a sensibilidade do meio. Portanto, atualmente é útil para a pesquisa de Salmonella em qualquer tipo de amostra, mas principalmente em fezes e alimentos sólidos ou líquidos.

Sua preparação consiste em duas fases; O meio comercial é uma base para a preparação do caldo de tetrationato e, subsequentemente, para que o tetrationato possa ser formado, é adicionada uma solução de iodo iodado que completa o meio.

A Associação Americana de Saúde Pública (APHA) recomenda o uso de caldo de tetrationato suplementado com verde claro para o enriquecimento de amostras em busca de Salmonella, uma vez que é mais seletivo que o caldo de tetrationato e o caldo de selenito.

Em geral, o caldo de tetrationato é ideal quando se suspeita da presença de bactérias do gênero Salmonella em pequenas quantidades ou que são maltratadas pela exposição a substâncias inibidoras ou por processos industriais que minimizam sua viabilidade.

Fundação

As peptonas presentes correspondem a caseína digerida pancreática e tecido animal digerido péptico. Eles fornecem a fonte de carbono, nitrogênio e nutrientes em geral para o crescimento bacteriano.

Por outro lado, o tiossulfato de sódio reage com a solução iodada para formar o tetrationato. Isso inibe o crescimento de coliformes e favorece o desenvolvimento de bactérias que contêm a enzima tetrationato redutase, entre elas o gênero Salmonella, mas também Proteus.

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Os sais biliares também atuam como um inibidor da maioria das bactérias Gram-positivas e algumas Gram-negativas (coliformes).

O carbonato de cálcio absorve substâncias tóxicas geradas pela decomposição do tetrationato, que forma o ácido sulfúrico . Nesse sentido, o carbonato de cálcio neutraliza a acidez, mantendo o pH do meio estável.

No caso da modalidade verde-clara, essa substância aumenta o poder seletivo do caldo de tetrationato, inibindo outros microorganismos além do gênero Salmonella.

Preparação

– Caldo de tetrationato

Solução de iodo iodo

Pesar:

  • 6 gr de iodo.
  • 5 gr de iodeto de potássio.

O iodeto de potássio é dissolvido em aproximadamente 5 ml de água destilada estéril, depois o iodo é adicionado gradualmente enquanto a mistura é aquecida. Depois de completamente dissolvido, é lavado com água destilada estéril até atingir um volume final de 20 ml.

Base média para caldo de tetrationato

Pesar 46 gramas do meio desidratado e suspender em 1 litro de água destilada estéril. Misturando e aquecendo até dissolver completamente, ele pode ferver apenas por alguns minutos. Não esterilize na autoclave. A base do meio é deixada arrefecer até aproximadamente 45 ° C e nessa altura são adicionados 20 ml da solução iodada.

Depois de adicionar a solução iodada ao meio, ela deve ser usada imediatamente. Se você não quiser usar a mistura inteira, faça o seguinte:

10 ml do meio base são distribuídos em tubos, e apenas os que serão inoculados com as amostras são adicionados 0,2 ml da solução iodada.

Os que não serão utilizados ainda podem ser armazenados na geladeira; no entanto, como o meio não é esterilizado, o ideal é preparar a quantidade exata necessária.

A cor do meio antes de adicionar a solução de iodo iodado é branca leitosa com precipitado branco e após agregado é marrom com um precipitado denso. O precipitado observado é normal e corresponde ao carbonato de cálcio que não se dissolve. O pH final do meio é 8,4 ± 0,2.

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-Vário caldo de tetrationato com verde brilhante

Para preparar o caldo de tetrationato verde-claro, todos os passos descritos acima são realizados, mas adicionalmente 10 ml da solução verde-clara preparada a 0,1% são adicionados à mistura.

Verde brilhante

Esta solução é preparada da seguinte maneira:

Pesar 0,1 g de verde brilhante e suspender em 100 ml de água destilada. Aqueça até ferver para alcançar sua dissolução total. Armazenar em jarra de âmbar.

Use

Para amostras de fezes ( coprocultura ), o protocolo é o seguinte:

Inocule 1 g de fezes sólidas ou 1 ml de fezes líquidas em um tubo com 10 ml de caldo de tetrationato pronto para uso. Agitar vigorosamente e incubar em aerobiose a 43 ° C por 6-24 horas.

Posteriormente, tome uma alíquota de 10 a 20 µl do caldo e subcultura em meio seletivo para Salmonella, como ágar SS, ágar XLD, ágar verde brilhante, ágar entérico Hektoen, entre outros.

Paralelamente, os meios seletivos para Salmonella devem ser inoculados com a amostra direta (fezes) sem enriquecimento.Para amostras de zaragatoa retal, descarregue o material coletado no tubo e proceda como descrito acima.

Para amostras de alimentos, pesar 10 g de alimento sólido ou 10 ml de alimento líquido e inocular uma garrafa com 100 ml de caldo de tetrationato pronto para uso. Proceda da mesma maneira como descrito acima, mas incube a 37 ° C.

Como você pode ver, a proporção entre a amostra e o caldo será sempre 1:10.

Controle de qualidade

Para testar o meio de cultura, podem ser utilizadas cepas de controle conhecidas. As mais utilizadas são as linhagens certificadas ATCC.

As cepas a serem usadas são Salmonella typhimurium ATCC 14028, Salmonella abony DSM 4224, Salmonella enteritidis ATCC 13076, Escherichia coli ATCC 25922, Enterococcus faecalis ATCC 19433 e Staphylococcus aureus ATCC 25923.

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É esperado um excelente desenvolvimento para as cepas de Salmonella, enquanto Escherichia coli pode ter um desenvolvimento fraco ou regular, e as cepas Gram-positivas (Enterococcus e Staphylococcus) são parcial ou totalmente inibidas.

Recomendações

-Como esse meio não inibe o crescimento de Proteus, alguns laboratórios geralmente colocam 40 mg / L de novobiocina para impedir o desenvolvimento dessa cepa microbiana. O antibiótico deve ser adicionado antes da solução de iodo.

– Após a preparação do meio, incluindo a solução de iodo, não deve demorar mais de 2 horas para ser inoculado.

-No momento da distribuição do meio nos tubos, a mistura deve ser homogeneizada continuamente para ressuspender o precipitado formado.

-Em amostras menos contaminadas, o caldo de tetrationato é incubado a 35-37 ° C, e em amostras altamente contaminadas é recomendada a incubação a 43 ° C.

Referências

  1. Laboratório Conda Pronadisa. 2010. Base de caldo de tetrationato de acordo com Müeller-Kauffmann. Disponível em:
  2. Laboratórios BD 2003. Base de caldo de tetrationato. Disponível em:
  3. Laboratórios britânicos. 2015. Caldo de base de tetrationato. Disponível em:
  4. Mídia BBL. 2005. Preparado em tubo para o cultivo de espécies de Salmonella.
  5. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnóstico microbiológico de Bailey & Scott. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
  6. Flores-Abuxapqui J, Puc-Franco M, Heredia-Navarrete M, Vivas-Rosel M, Franco-Monsreal J. Comparação entre meios de cultura de selenito de sódio e tetrationato de sódio, ambos incubados a 37 ° C e 42 ° C por o isolamento de Salmonella spp das fezes dos portadores. Rev Biomed 2003; 14 (4): 215-220

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