Coloração de Kinyoun: fundação e técnicas

A coloração de Kinyoun é uma técnica de coloração utilizado para bactérias e parasitas mancha de álcool de ácido resistentes. Nasceu da modificação da coloração de Ziehl-Neelsen ; Ambas as técnicas são interpretadas da mesma maneira, mas diferem em dois elementos: na preparação do reagente principal e no fato de a técnica de Kinyoun não usar calor.

Por esse motivo, também é conhecido como coloração a frio Ziehl-Neelsen ou Kinyoun modificada a frio. É indicado para a coloração de Mycobacterium tuberculosis , Mycobacterium leprae , micobactérias atípicas, Nocardias sp , Criptosporidium parvum, Criptosporidium meleagridis, Criptosporidium felis, Criptosporidium muris e Cyclosporas cayetanensis .

Coloração de Kinyoun: fundação e técnicas 1

Cryptosporidium parvum corado com coloração de Kinyoun. Punlop Anusonpornperm [CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0)], do Wikimedia Commons

Vale ressaltar que as Nocardias são coradas fracamente com essa técnica, pois são álcool parcialmente resistente a ácidos; portanto, para esse gênero, há uma modificação da metodologia.

Por sua vez, a técnica de frio de Kinyoun foi combinada com a técnica de tricrômico modificada por Didier para a detecção de esporos de coccídios ( Criptosporidium parvum e Isospora belli ) e microsporidium ( Enterocytozoon bieneusi e Encephalitozoon intestinalis ).

Fundação

O principal reagente da coloração é a carbol-fucsina ou fenólica-fucsina, que tem a propriedade de se ligar aos ácidos carbônicos na parede celular cerosa, rica em lipídios (ácidos micólicos) de micobactérias e certos parasitas.

Essa ligação não é neutralizada pelo branqueamento ácido; Portanto, os microrganismos são definidos como álcool resistente a ácidos.

Diferentemente da técnica de Ziehl-Neelsen – que fixa o corante através do calor -, na técnica de Kinyoun esse passo não é necessário, pois a solução fenólica de fucsina preparada para essa técnica contém uma alta concentração de fenol.

O fenol dissolve o material lipídico da parede celular, permitindo a entrada do corante carbol fucsina. Depois que o corante penetra, ele permanece fixo, apesar da lavagem com o álcool ácido.

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Dessa maneira, os microrganismos ácidos alcoólicos resistentes assumem a cor vermelha característica, enquanto tudo o que não é álcool resistente a ácidos fica descolorido e manchado de azul.

Técnica

Materiais

– fucsina fenólica modificada.

– Álcool – ácido.

– Azul de metileno.

Preparação de Kinyoun Phenolic Fuchsin

– Fuchsina básico: 4 gr.

– Fenol: 8 ml.

– Álcool (95%): 20 ml.

– Água destilada: 100 ml.

A fucsina básica deve ser dissolvida lentamente no álcool, misturando-se constantemente. Posteriormente, o fenol cristalizado é derretido em banho-maria a 56 ° C. Uma vez dissolvido, são adicionados 8 ml à solução de fucsina preparada acima.

Preparação de álcool e ácido

– Ácido clorídrico concentrado: 3 ml.

– Etanol (95%): 97 ml.

Deve ser medido, unido e misturado.

Preparação do contraste azul de metileno

– Azul de metileno: 0,3 g.

– Água destilada: 100 ml.

É pesado e dissolvido.

Técnica de coloração Kinyoun

1- Preparar um esfregaço diretamente da amostra, que pode ser expectoração, líquido pulmonar, sedimento urinário, líquido cefalorraquidiano ou fezes, entre outros; ou de uma suspensão de microrganismos obtidos de colônias puras desenvolvidas em meios de cultura primários.

2- Fixe o esfregaço com calor.

3- Coloque o esfregaço na ponte de coloração e cubra com o reagente fenólico de fucsina Kinyoun preparado. Deixe descansar por 3 ou 5 minutos.

4- Lave com água destilada.

5- Alveje com álcool ácido por 3 minutos e lave novamente com água destilada.

6- Alveje novamente com álcool ácido por 1 ou 2 minutos, até que nenhum corante seja arrastado.

7- Lave com água destilada e escorra, colocando a lâmina na posição vertical.

8- Cubra a preparação com azul de metileno e deixe por 4 minutos.

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9- Lave com água destilada e deixe secar ao ar.

10- Examine em 40X e depois em 100X.

Se você quiser melhorar e acelerar a coloração de microorganismos ácidos resistentes ao álcool, adicione 1 gota de um agente umectante (como o tergitol nº 7) a 30 ou 40 ml da fucsina fenólica de Kinyoun.

Alguns laboratórios alteram o corante de contraste azul de metileno para verde brilhante ou ácido pítrico; o primeiro dá uma cor verde ao fundo e o segundo gera uma cor amarela.

Técnica Kinyoun especial para Nocardias

Para melhorar a coloração das bactérias do gênero Nocardia, é utilizada uma modificação da coloração de Kinyoun. A técnica é a seguinte:

1- Cubra o esfregaço com fucsina fenólica Kinyoun por 3 minutos.

2- Lave com água destilada.

3- Alveje brevemente com álcool alcoólico preparado a 3%, até que nenhum corante seja arrastado.

4- Lave novamente com água destilada.

5- Cubra a preparação com azul de metileno e deixe por 30 segundos.

6- Lave com água destilada e deixe secar ao ar.

Técnica combinada de fucsina fenólica e tricrômica modificada por Didier

Essa técnica é recomendada para a análise de amostras de fezes de coccídios e esporos de Microsporidium sp ao mesmo tempo. O procedimento a seguir é o seguinte:

1- Cubra o esfregaço com fucsina fenólica Kinyoun por 10 minutos.

2- Remova o corante e lave com água destilada.

3- Alveje por 30 segundos com álcool clorídrico.

4- Lave novamente com água destilada.

5- Cubra o esfregaço com solução tricrômica por 30 minutos a 37 ° C.

6- Lave com água destilada.

7- Alveje por 10 segundos com álcool ácido acético.

8- Lave o esfregaço por 30 segundos com etanol a 95%.

Controle de qualidade

Como controle positivo, esfregaços são preparados com cepas de Micobacterium tuberculosis e corados com os reagentes preparados para verificar se as bactérias têm a cor certa (vermelho-fúcsia).

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Controles negativos também podem ser usados ​​preparando manchas com qualquer outra cepa que não seja álcool resistente a ácidos, verificando se a amostra inteira tem a cor de contraste.

Técnica de Kinyoun comparada à técnica de Ziehl-Neelsen

A técnica de Kinyoun é mais simples, pois elimina a passagem do aquecimento, mas sua principal vantagem é que evita a emissão de vapores altamente tóxicos que causam câncer a longo prazo. Portanto, a coloração de Kinyoun é mais segura para o pessoal encarregado da coloração.

É importante levar em consideração que deve-se tomar cuidado para que os reagentes não entrem em contato direto com a pele, pois são corrosivos e o alvejante é inflamável.

Quanto às desvantagens, um esfregaço negativo não indica necessariamente que o microrganismo não está presente. Além disso, a presença de detrito celular pode causar falsos positivos, o que gera confusão no diagnóstico.

Referência

  1. Química Clínica Aplicada. (2016). BK Kinyoun Kit. Disponível em: cromakit.es
  2. Orozco-Rico Miguel. Coloração de Kinyoun e dois Coccídios no HIV. MD Medical Magazine. 2011; 3 (2): 137
  3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A (2009). Diagnóstico microbiológico de Bailey & Scott. 12 ed. Argentina Editorial Panamericana SA
  4. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnóstico microbiológico (5ª ed.). Argentina, Editorial Panamericana SA
  5. Contribuidores da Wikipedia. «Mancha de Kinyoun.» Wikipedia, A Enciclopédia Livre . Wikipedia, The Free Encyclopedia, 8 de fevereiro de 2018. Web. 5 de janeiro de 2019.
  6. Combol A, Fernández N, Figueredo E, Acuña A, Zanetta E. Implementação de uma técnica de coloração para o diagnóstico simultâneo de Coccidia e Microsporidia. Instituto de Higiene da Universidade da República. Montevidéu Uruguai Disponível em: hygienic.edu.uy

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