A técnica de coloração de Gram, desenvolvida pelo bacteriologista dinamarquês Hans Christian Gram em 1884, é amplamente utilizada na microbiologia para diferenciar e classificar bactérias com base em suas características de parede celular. A técnica envolve a coloração de bactérias com cristal violeta, seguido por iodeto de potássio, álcool e safranina, resultando na divisão das bactérias em dois grupos distintos: as Gram-positivas, que retêm a cor violeta, e as Gram-negativas, que adquirem a cor vermelha. A técnica de Gram é fundamental para a identificação de bactérias em laboratórios de microbiologia clínica e pesquisa, sendo amplamente utilizada na identificação e classificação de microrganismos patogênicos e não patogênicos.
Materiais empregados na técnica de coloração de Gram: uma lista completa.
Na técnica de coloração de Gram, utilizam-se diversos materiais para realizar a coloração diferencial de bactérias. A lista completa dos materiais empregados inclui:
- Cristal violeta: corante primário utilizado para corar todas as células bacterianas.
- Lugol: solução de iodo utilizada como fixador do corante violeta.
- Álcool acetona: utilizado como agente descolorante para remover o corante das bactérias Gram-negativas.
- Safranina: corante de contra-coloração utilizado para corar as bactérias Gram-negativas.
- Lâminas e lamínulas: utilizadas para preparar esfregaços bacterianos.
- Microscópio: para observar as bactérias após a coloração de Gram.
Estes materiais são essenciais para a realização da técnica de coloração de Gram, um procedimento fundamental na microbiologia para diferenciar bactérias com base na composição da parede celular. A técnica de coloração de Gram foi desenvolvida pelo bacteriologista dinamarquês Hans Christian Gram em 1884 e continua sendo amplamente utilizada até hoje.
Como realizar corretamente a técnica de coloração de Gram em microbiologia.
A técnica de coloração de Gram é um procedimento fundamental em microbiologia, que permite diferenciar e classificar bactérias com base na composição da parede celular. Desenvolvida pelo cientista dinamarquês Hans Christian Gram em 1884, a técnica de coloração de Gram é amplamente utilizada até hoje.
Para realizar corretamente a coloração de Gram, é necessário ter em mãos os materiais adequados, como cristal violeta, solução de lugol, álcool etílico e safranina. Além disso, é importante seguir corretamente os passos da técnica, para obter resultados precisos e confiáveis.
O primeiro passo da coloração de Gram é fixar a amostra em uma lâmina de vidro e em seguida cobri-la com cristal violeta, que irá corar as células. Após isso, é realizada a adição da solução de lugol, que atua como um fixador do corante. Em seguida, é feita a lavagem com álcool etílico, que irá remover o corante das bactérias Gram-negativas, mas não das Gram-positivas.
Por fim, a lâmina é corada com safranina, que irá corar as bactérias Gram-negativas. As bactérias Gram-positivas permanecerão coradas de violeta, enquanto as Gram-negativas ficarão coradas de rosa. A observação ao microscópio permitirá a identificação e classificação das bactérias com base em sua parede celular.
A técnica de coloração de Gram é amplamente utilizada em microbiologia, sendo essencial para a identificação de bactérias em laboratórios clínicos, pesquisas científicas e indústria alimentícia. Portanto, é fundamental dominar corretamente essa técnica para obter resultados precisos e confiáveis nas análises microbiológicas.
Princípio e aplicação da coloração de Gram em diagnósticos microbiológicos: como funciona?
Mancha de Gram: fundação, materiais, técnica e usos.
A coloração de Gram é uma técnica essencial em microbiologia para diferenciar bactérias com base na composição de suas paredes celulares. Desenvolvida pelo bacteriologista dinamarquês Hans Christian Gram em 1884, a técnica envolve a utilização de corantes específicos que permitem a classificação das bactérias em dois grupos principais: Gram-positivas e Gram-negativas.
Os materiais utilizados na coloração de Gram incluem cristal violeta, lugol, álcool etílico e safranina. O processo em si consiste em adicionar o cristal violeta às bactérias, seguido pela adição do lugol que atua como fixador, o álcool etílico que desidrata as células e por fim a safranina que age como contracorante.
A técnica de coloração de Gram é realizada em várias etapas, seguindo um protocolo específico para garantir resultados precisos. Uma vez finalizada a coloração, as bactérias Gram-positivas aparecem na cor roxa, enquanto as Gram-negativas são coradas de rosa.
Os usos da coloração de Gram são variados, sendo amplamente utilizada em diagnósticos microbiológicos, identificação de agentes infecciosos, seleção de tratamentos antibióticos e estudos epidemiológicos. A técnica é fundamental para a correta identificação de bactérias e auxilia os profissionais de saúde a tomarem decisões terapêuticas adequadas.
Importância da coloração de Gram na identificação de bactérias em laboratórios de microbiologia.
A coloração de Gram é uma técnica fundamental utilizada em laboratórios de microbiologia para identificação de bactérias. Desenvolvida pelo médico dinamarquês Hans Christian Gram em 1884, a técnica se tornou amplamente utilizada devido à sua eficácia e simplicidade.
Para realizar a coloração de Gram, são necessários alguns materiais básicos, como cristal violeta, lugol, álcool acetona e safranina. A técnica consiste em fixar a amostra bacteriana em uma lâmina de vidro, aplicar os corantes na seguinte ordem: cristal violeta, lugol, álcool acetona e safranina, e observar ao microscópio.
A coloração de Gram é importante porque permite diferenciar as bactérias em dois grupos principais: bactérias Gram-positivas e bactérias Gram-negativas. Essa distinção é crucial para determinar o tratamento adequado em casos de infecções bacterianas, uma vez que as duas categorias respondem de forma diferente a antibióticos.
Além disso, a coloração de Gram também auxilia na identificação de patógenos, na classificação de amostras clínicas e na pesquisa científica. Portanto, é uma técnica essencial para os profissionais da área de microbiologia, contribuindo para a saúde pública e o avanço da ciência.
Mancha de Gram: fundação, materiais, técnica e usos
A coloração de Gram é coloração técnica mais simples e mais útil de diagnóstico, em microbiologia. Essa técnica foi criada pelo médico dinamarquês Hans Christian Gram em 1884, que conseguiu classificar as bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, de acordo com a composição da parede celular .
A técnica passou por certas modificações por Hucker em 1921 para estabilizar os reagentes e melhorar a qualidade da coloração, de modo que a coloração de Gram também é conhecida como Gram-Hucker.
Com esta técnica também é possível observar a forma dos microrganismos, ou seja, se são cocos, bacilos, cocobacilos, pleomórficos, filamentosos, entre outros. Assim como sua distribuição no espaço: em cluster, em cadeia, isolado, em pares, em tetrades, etc.
Quando houver suspeita de infecção bacteriana, a maioria das amostras recebidas deve ser espalhada na lâmina e corada com Gram para ser examinada ao microscópio.
O relatório Gram orientará o médico sobre que tipo de microorganismo pode ser a causa da infecção, antes de obter o resultado definitivo da cultura.
Em alguns casos, a vida do paciente é muito comprometida; portanto, os médicos precisam urgentemente do relatório Gram para realizar um tratamento empírico, enquanto aguardam a identificação do microorganismo.
Por exemplo, se o Gram revelar que há cocos Gram-positivos no líquido cefalorraquidiano, o médico orientará a terapia inicial com antibióticos que eliminam esse tipo de bactéria, de acordo com os protocolos estabelecidos.
Quando o resultado final chegar com o nome do microrganismo isolado e seu respectivo antibiograma, o médico avaliará se deve ou não alterar a terapia. Esta decisão será tomada de acordo com o estudo de suscetibilidade do microrganismo aos antibióticos que está recebendo e a evolução do paciente.
Fundação
Esta é uma técnica que apresenta 4 etapas fundamentais: coloração, fixação com mordente, descoloração e contratação. Portanto, além de colorir as bactérias, essa técnica também permite diferenciação.
O cristal violeta é o primeiro corante usado. Tem uma afinidade pelo peptidoglicano e manchará todas as bactérias presentes em púrpura; em seguida, colocará o lugol, que age como mordente, ou seja, induzirá a formação de complexos insolúveis de cristal violeta-iodo – proteínas ribonucleares no interior da célula. .
Bactérias gram-positivas, com uma parede peptidoglicana espessa, formam mais complexos (cristal violeta-iodo), retendo o corante.
Além disso, também influencia que a parede das bactérias Gram-positivas contenha uma quantidade maior de ácidos insaturados, que mostram grande afinidade pelos agentes oxidantes (Lugol).
Enquanto isso, as bactérias Gram-negativas têm uma fina camada de peptidoglicano, que faz com que as bactérias se formem menos complexas que as Gram-positivas.
Depois vem a etapa da descoloração, onde as bactérias Gram-positivas e Gram-negativas se comportam de maneira diferente.
As bactérias gram-negativas contêm uma membrana externa rica em lipopolissacarídeos que faz parte de sua parede celular. As gorduras são destruídas pelo contato com o álcool acetona, de modo que a membrana externa é desestabilizada e o cristal violeta é liberado.
É assim que ele é contrastado com a safranina ou fucsina básica, assumindo a cor vermelha.
No caso das bactérias Gram-positivas, elas resistem ao desbotamento porque o alvejante age fechando os poros, o que impede que o complexo de cristal violeta / iodo saia.
Portanto, a coloração com o cristal violeta permanece estável e não há lugar para safranina ou fucsina. É por isso que essas bactérias mancham azul profundo ou roxo.
Materiais
O conjunto de colorir Gram é composto por:
- Violeta cristal
- Lugol
- Álcool acetona
- Safranina ou fucsina básica
Preparação de corantes e reagentes
Solução de cristal violeta
Solução A:
Cristal violeta – 2 – 2 gr
Álcool etílico a 95% —————————— 20cc
Solução B:
Oxalato de amônio ——————————— 0.8 gr
Água destilada ———————————— 80 cc
Para a preparação final do cristal violeta, a solução A 1:10 deve ser diluída com água destilada e misturada com 4 partes da solução B. A mistura é armazenada por 24 horas antes do uso. Filtrar em uma garrafa para manchas de âmbar usando um filtro de papel.
A quantidade a ser usada diariamente é transferida para uma garrafa de âmbar com conta-gotas.
Iodo-Lugol
Pesar e medir a quantidade indicada de cada composto, como a seguir:
Cristais de Iodo ——— 1gr
Iodeto de potássio – 2 – 2gr
Água destilada ———————————— 300 cc
O iodeto de potássio é dissolvido pouco a pouco na água e, posteriormente, o iodo é adicionado. A solução é raspada em uma garrafa de âmbar.
A quantidade a ser usada diariamente é transferida para um frasco âmbar menor com conta-gotas.
Branqueamento
Álcool etílico a 95% ——————————— 50 ml
Acetona ————————————————-
É preparado em partes iguais. Cubra bem, ele tende a evaporar.
Coloque no pote com conta-gotas.
Esta preparação fornece uma descoloração em tempo moderado de 5 a 10 segundos e é a mais recomendada.
Iniciantes preferem usar apenas álcool etílico a 95%, onde a descoloração é mais lenta de 10 a 30 segundos.
Enquanto os mais experientes podem usar acetona pura, onde o desbotamento ocorre muito rapidamente por 1 a 5 segundos.
Contraste
Solução-mãe de safranina
Safranina ————————————— 2.5 gr
Álcool etílico a 95% ————————– 100 cc
Após a pesagem, a quantidade indicada de safranina é dissolvida em 100 ml de álcool etílico a 95%.
A solução de safranina de trabalho é preparada a partir da solução de estoque.
Para fazer isso, meça 10 cm da solução padrão e adicione 90 cm de água destilada para completar 100 ml.
Recomenda-se transferir a quantidade a ser usada diariamente para uma garrafa de âmbar com conta-gotas.
Os microrganismos de coloração Gram-negativos com Gram-Hucker, como certos anaeróbios, Legionella sp, Campylobacter sp e Brucella sp , podem ser corados muito melhor se a modificação de Kopeloff à coloração Gram-Hucker for usada, chamada coloração de Gram-Kopeloff.
Essa técnica altera o corante safranina para fucsina básica. Com esta modificação, é possível colorir efetivamente os microrganismos mencionados acima.
Armazenamento de reagentes
Os corantes preparados devem ser armazenados em temperatura ambiente.
Preparação da amostra estendida para colorir
Uma amostra deve conter pelo menos 10 5 microrganismos antes que seja provável a observação do microrganismo em um esfregaço.As propagações podem ser feitas a partir da amostra direta ou de culturas em meio sólido ou líquido.
As estendidas devem ser uniformes, bem distribuídas e não muito grossas, para melhor visualização das estruturas presentes.
-Gram de amostras diretas
Grama de urina sem girar
A urina é misturada e 10 µl são colocados em uma lâmina. A observação de pelo menos um campo de bactéria / imersão indica infecção.
Isto significa que a cultura terá aproximadamente 100,000 CFU / ml (10 5 CFU / ml) de urina em 85% dos casos.
Este método não é útil para contagens de colônias abaixo de 100.000 UFC.
Grama no LCR
O LCR deve ser centrifugado, o sobrenadante é removido e o sedimento é espalhado em uma lâmina. Este líquido é estéril em condições normais; A observação de bactérias indica infecção.
Grama de amostras respiratórias
Grama de escarro, lavagem brônquica ou broncoalveolar, embora possa haver uma variedade de microrganismos, sempre orientará o diagnóstico, além de ser útil o tipo de célula observada.
No caso de escarro, a propagação deve ser preparada com as porções mais purulentas da amostra.
Grama de fezes
Gram não é recomendado para este tipo de amostra, pois não possui valor diagnóstico.
-Gram de culturas
Eles podem ser feitos de duas maneiras, uma de culturas líquidas e outra de culturas sólidas.
Culturas líquidas
De culturas líquidas é extremamente simples; Sob o queimador, vários assados do caldo nublado são tomados e colocados em uma lâmina limpa e seca, dando movimentos circulares do centro para a periferia, para distribuir o material uniformemente.
É permitido secar espontaneamente no ar. Depois de seco, o material é fixado à chapa com calor. Para isso, com a ajuda de um grampo, a folha é passada de 3 a 4 vezes pela chama do queimador de Bunsen, tomando cuidado para não queimar o material.
A folha é deixada esfriar e colocada na ponte de coloração.
Culturas sólidas
Para executar uma extensão para coloração de Gram de uma cultura sólida, proceda da seguinte maneira:
Antes de escolher as colônias a serem colhidas, a lâmina deve ser preparada, colocando aproximadamente duas gotas de soro fisiológico estéril.
Se a placa de cultura original contiver vários tipos diferentes de colônias, uma colônia isolada de cada será escolhida para produzir o Gram. Cada colônia será coletada com a alça de platina para dissolvê-la na solução salina previamente colocada na lâmina.
Movimentos circulares são dados do centro para a periferia, para distribuir homogeneamente a colônia no slide.
É permitido secar espontaneamente no ar. Depois de seca, a chapa é fixada com calor, como explicado acima (inflamando a lâmina com o isqueiro), tomando cuidado para não queimar o material.
Este procedimento deve ser realizado com cada tipo de colônia diferente. A ordem do observado deve ser anotada em um artigo, por exemplo:
Colônia 1: Colônia amarela beta-hemolítica: Cocos Gram-positivos foram observados em aglomerados
Colônia 2: Colônia de cor creme, sem hemólise: foram observados cocobacilos Gram-negativos.
Cada folha deve ser rotulada para saber o que estamos observando.
Técnica
A técnica de coloração de Gram é extremamente simples de executar e relativamente barata e não pode faltar em um laboratório de microbiologia.
Isso é feito da seguinte maneira:
- Corrija o esfregaço com calor e coloque-o na ponte para colorir.
- A folha é completamente coberta com cristal violeta por 1 minuto.
- Lave com água. Não seco
- Cubra a folha com solução de lugol e deixe por 1 minuto. Lave com água. Não secar
- Alveje por 5-10 segundos com agitação suave em álcool acetona. Ou coloque a folha na posição vertical e solte gotas da lixívia na superfície até arrastar o vidro violeta não retido restante. Não exceder.
- Lave com água. Não secar
- Substitua a folha na ponte de coloração e cubra por 30 segundos com safranina (Gram-Hucker) ou 1 min com fucsina básica (Gram-Kopeloff).
- Lave com água
- Deixe o ar secar espontaneamente na posição vertical.
Depois de seco, coloque 1 gota de óleo de imersão para observá-lo com o objetivo de 100X no microscópio óptico.
Utilitário
Essa técnica permite distinguir diferenças morfotécnicas da maioria das bactérias.
Leveduras também se distinguem com esta coloração. Eles pegam o cristal violeta, ou seja, mancham Gram-positivos.
Por outro lado, é possível distinguir os bacilos Gram-positivos formadores de esporos, nos quais é observado um espaço livre dentro do bacilo, onde a endosporo se formou, embora os esporos não mancham bem. Para tingir esporos, são utilizadas outras técnicas como Shaeffer-Fulton.
Deve-se notar que essa coloração não serve para colorir todos os tipos de bactérias, ou seja, há casos em que a coloração não funciona.
Nesse caso, bactérias que não possuem parede celular podem ser mencionadas. Por exemplo: gênero Mycoplasma, esferoplastos, Ureaplasma, formas L e protoplastos.
Também mancha muito as bactérias com paredes ricas em ácidos micólicos, como micobactérias e bactérias intracelulares, como clamídias e riquetsias.
Também é ineficaz na coloração da maioria das bactérias espirochetianas.
Existem bactérias do mesmo gênero que podem ser vistas na mesma amostra que Gram-positivas e Gram-negativas. Quando isso acontece, é denominada coloração variável de Gram, que pode ser causada por alteração dos nutrientes, temperatura, pH ou concentração de eletrólitos.
Erros comuns
Alvejante excessivo
Exagerar no passo de branqueamento pode causar a observação de microorganismos Gram-negativos falsos.
Não espere o tempo suficiente para secar para adicionar o óleo de imersão :
Esse erro causa a formação de micelas gordurosas que dificultam a observação das estruturas presentes. Isso ocorre quando o óleo se liga às moléculas de água presentes no esfregaço.
Inverta a ordem dos reagentes :
Um erro como esse fará com que bactérias Gram-negativas apareçam roxas, ou seja, Gram-positivas falsas.
Use culturas antigas (sólidas ou líquidas):
Pode fazer com que bactérias Gram-positivas mancham Gram-negativos (falsos Gram-negativos). Isso acontece porque em culturas antigas é provável que haja bactérias mortas ou danificadas e, nessas condições, as bactérias não retêm o cristal violeta.
Use uma solução de lugol muito antiga:
Com o tempo, Lugol perde suas propriedades e sua cor desaparece. Se o reagente já degenerado for utilizado, ele não fixará bem o cristal violeta; portanto, é possível obter uma visualização de microorganismos Gram-negativos falsamente.
Fundo azul
Um fundo adequadamente descolorido ficará vermelho. Um fundo azul indica que a descoloração foi insuficiente.
Referências
- Ryan KJ, Ray C. 2010. Sherris .Medical Microbiology , 6ª edição McGraw-Hill, Nova York, EUA
- Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnóstico microbiológico (5ª ed.). Argentina, Editorial Panamericana SA
- Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Diagnóstico microbiológico de Bailey & Scott. 12 ed. Argentina Editorial Panamericana SA
- Casas-Rincón G. 1994. Micologia Geral. 2ª Ed. Universidade Central da Venezuela, edições da Biblioteca. Venezuela, Caracas
- «Gram stain.» Wikipedia, a enciclopédia livre . 4 de outubro de 2018 às 23:40 UTC. 9 de dezembro de 2018 às 17:11. Retirado de es.wikipedia.org.
- González M, González N. 2011. Manual de Microbiologia Médica. 2ª edição, Venezuela: Gerenciamento de mídia e publicações da Universidade de Carabobo.
- López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. As manchas básicas no laboratório de microbiologia. Pesquisa sobre Deficiência. 2014; 3 (1): 10-18.