Tampão de Fosfato (PBS): justificativa, preparação e usos

O tampão fosfato, BPS ou solução salina tamponada com fosfato é uma solução tampão e isotônica, cuja função é manter o pH e a pressão osmótica o mais próximo possível do ambiente biológico (fisiológico) natural. A sigla PBS significa solução salina tamponada com fosfato.

PH e osmolaridade são dois aspectos muito importantes que devem ser controlados em certos protocolos de laboratório. No caso do pH, é essencial que ele seja controlado, principalmente em reações bioquímicas, pois elas podem variar ou não funcionar se os reagentes estiverem com um pH inadequado.

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PBS tampão fosfato salino em dois pH diferentes. Fonte: Pixinio.com

Enquanto, o controle da osmolaridade é essencial, especialmente quando se trabalha com células vivas, uma vez que as membranas plasmáticas das células reagem de acordo com a concentração de solutos em que são encontradas.

Se as células forem transferidas para um meio hipertônico, elas serão desidratadas, uma vez que o gradiente de água será transportado para o lado onde há uma maior concentração de solutos. Se, pelo contrário, as células forem colocadas em um meio hipotônico, as células absorverão o líquido até que sejam lisadas.

É por isso que o tampão PBS é usado em protocolos de laboratório que exigem a manutenção de células in vitro , para que as células não sejam danificadas.

O PBS é composto por uma combinação de sais, como cloreto de sódio, fosfato de sódio, cloreto de potássio e fosfato de potássio. A composição do PBS pode variar dependendo do protocolo.

Fundação

Basicamente, a função da solução salina tamponada com fosfato é manter um pH fisiológico constante juntamente com uma concentração de eletrólitos semelhante à encontrada no interior do corpo.

Nesse ambiente, as células são capazes de permanecer estáveis, pois as condições fisiológicas são simuladas o máximo possível.

Outros compostos, se necessário, podem ser adicionados à formulação original de PBS, por exemplo, a adição de EDTA ao tampão é útil para lavar glóbulos vermelhos no teste de incompatibilidade cruzada.

O EDTA impede que a fração do complemento C1 presente no soro seja clivada e lisando os glóbulos vermelhos, ou seja, evita resultados falsos de incompatibilidade. Além disso, o EDTA ajuda a dissociar as células.

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Preparação

A quantidade de sais que devem ser pesados ​​para a preparação do tampão fosfato salino PBS dependerá da quantidade que precisa ser preparada:

– Solução salina tamponada com fosfato tamponado (PBS 10X)

Para um litro de solução:

Pesar:

80,6 g de NaCl,

2,2 g de KCl,

11,5 g de Na 2 HPO 4 ,

2,0 g de KH 2 HPO 4

Técnica de Preparação

Em um copo, coloque os sais pesados, adicione água suficiente (80%) e misture na barra de agitação com a barra magnética até que os sais se dissolvam.

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Preparação do PBS usando barra de agitação com barra magnética. Fonte: Usuário: Ruhrfisch, Wikipedia. com

Filtre para remover partículas não dissolvidas. Use filtros com poros de 0,45 µm. Esterilize em uma autoclave e distribua assepticamente em uma coifa de fluxo laminar em frascos de vidro com tampa.

O pH não é ajustado para a solução 10X (concentrada). O ajuste é feito uma vez diluído para a concentração de tampão 1X PBS (diluição 1:10).

– Solução salina fosfato-tampão (PBS 1X)

O PBS 1X pode ser preparado diretamente, pesando as quantidades correspondentes de cada sal ou pode ser preparado diluindo a solução estoque (1:10) com água destilada estéril.

-Para preparar diretamente um litro de tampão fosfato salino PBS 1X, eses:

8,06 g de NaCl,

0,22 g de KCl,

1.15 g de Na 2 HPO 4 ,

0,20 g de KH 2 HPO 4

Técnica de Preparação

Prossiga conforme explicado na solução concentrada. Posteriormente, o pH deve ser ajustado. Para fazer isso, meça o pH e, dependendo do resultado, use ácido (HCl) ou base (NaOH) para diminuir ou aumentar o pH, respectivamente, conforme necessário, até que seja 7,4.

O ácido ou base é adicionado gota a gota enquanto o valor de pH da solução é monitorado usando um medidor de pH. Filtrar, esterilizar em autoclave e distribuir assepticamente em tubos ou frascos cônicos, conforme necessário.

-Para preparar o 1X PBS a partir da solução de estoque 10X:

Realize uma diluição de 1:10. Por exemplo, para preparar 1 litro de PBS 1X, meça 100 ml da solução-mãe e adicione 700 ml de água destilada estéril. Ajuste o pH e complete a quantidade de água para atingir 1000 ml.

O tampão PBS preparado é incolor e transparente.

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O PBS para uso diário pode ser armazenado em temperatura ambiente e o restante em uma geladeira.

.Soluções para ajuste de pH

HCl

Para 100 ml de HCL (ácido clorídrico) a 1 molar.

Meça 91 ml de água destilada e coloque-a em um copo de 250 ml.

Meça 8,62 mL de HCl concentrado e adicione-o lentamente ao copo que contém a água (nunca faça o contrário). Tome as medidas relevantes de biossegurança ao manusear ácidos fortes (substância altamente corrosiva).

Misture por 5 minutos, de preferência usando uma placa de agitação com uma barra magnética dentro do copo. Transferir para a bola de 100 ml e até 100 ml com H 2 O destilada.

NaOH

Para 100 ml de NaOH (hidróxido de sódio) 10 molares.

Meça 40 mL de água destilada e coloque-a em um copo de 250 ml. Meça 40 g de NaOH e adicione à água. Misture usando uma placa de agitação com uma barra magnética dentro do copo.

Mover para um balão volumétrico de 100 ml e completar o volume com água destilada. Cumprir os padrões de biossegurança, porque essa reação é exotérmica (libera energia na forma de calor).

Se você deseja preparar outras quantidades de solução salina de fosfato, consulte a tabela a seguir:

Tampão de Fosfato (PBS): justificativa, preparação e usos 3

Fonte: «Laboratório de Genômica Viral e Humana, Faculdade de Medicina da UASLP»

Usos

É usado principalmente em laboratórios de biologia celular, imunologia, imuno-histoquímica, bacteriologia, virologia e pesquisa.

É ideal para lavagens celulares por centrifugadoras (glóbulos vermelhos), lavagens em monocamada celular, em técnicas de elipsometria espectroscópica, na quantificação de biofilmes bacterianos, na manutenção de culturas celulares para vírus, como solução de lavagem na técnica de imunofluorescência indireta e em técnicas para a caracterização de anticorpos monoclonais.

Também serve para transportar células ou tecidos, como um diluente para a contagem de células, a preparação de enzimas celulares (tripsina), como um diluente do método de secagem de biomoléculas e para a preparação de outros reagentes.

Por outro lado, Martin e colaboradores em 2006 demonstraram que o PBS é útil em laboratórios de ciências forenses, especificamente na recuperação de esperma de esfregaços vaginais ou na recuperação de células vaginais de esfregaços penianos. Dessa forma, você pode estabelecer se houve um relacionamento sexual.

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Limitações

-Alguns tampões de PBS trazem como conservante uma substância chamada azida de sódio. Este composto pode gerar substâncias explosivas se entrar em contato com chumbo ou cobre. Por esse motivo, deve-se tomar cuidado especial ao descartar este reagente pelo ralo. Se descartado por esta rota, muita água deve ser adicionada para diluir ao máximo.

-O tampão de zinco não deve ser adicionado zinco, pois causa a precipitação de alguns sais.

-Wangen e colaboradores em 2018 determinaram que o uso de PBS não era adequado para a lavagem de células primárias de leucemia mielóide aguda (LMA) extraídas do sangue periférico, porque muitas células são perdidas por lise, com uma grande diminuição no material proteína

Portanto, eles determinaram que as células primárias de LMA não deveriam ser lavadas com PBS após armazenamento em nitrogênio líquido.

Referências

  1. Coll J. (1993). Técnicas de diagnóstico em virologia. Ed Diaz de Santos. 360 pg
  2. Rodríguez M, Ortiz T. Cultura de células. Mudança de Meio Departamento de Citologia e Histologia Normal e Patológica da Universidade de Sevilha. Disponível em personal.us.es
  3. Preparação de solução salina tamponada com fosfato (PBS). (2008). Laboratório de Procedimentos Operacionais Padrão (POPs) da Faculdade de Medicina de Genômica Viral e Humana da UASLP. Disponível em: genomica.uaslp.mx
  4. «Tampão fosfato salino.» Wikipedia, A enciclopédia livre . 3 de abr de 2019 às 19:36 UTC 13 Abr 2019, 02:57 en.wikipedia.org.
  5. Pietrasanta L, Von-Bilderling C. Tópicos em biofísica molecular. Disponível em: users.df.uba.ar
  6. Rediar Manual de instruções. PBS + EDTA. Disponível em: felsan.com.ar
  7. Martin NC, Pirie AA, Ford LV, Callaghan CL, McTurk K, Lucy D, Scrimger DG. O uso de solução salina tamponada com fosfato para a recuperação de células e espermatozóides de zaragatoas. Sci Justice. 2006; 46 (3): 179-84. Disponível em: ncbi.nlm.nih.gov
  8. Wangen R., Aasebø E, Trentani A, et al . O método de preservação e a lavagem com solução salina tamponada com fosfato afetam o proteoma agudo da leucemia mielóide.Int J Mol . Sci . 2018; 19 (1): 296. Disponível em: ncbi.nlm.nih.gov
  9. Martínez R, Gragera R. (2008). Fundamentos teóricos e práticos da histoquímica. Conselho Superior de Pesquisa Científica. Madrid Disponível em: books.google.co.ve

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