Ágar Sabouraud: fundação, preparação e usos

O agar de Sabouraud , também conhecido como agar de dextrose Sabouraud, é um meio sólido, especialmente enriquecido para o isolamento e o desenvolvimento de fungos, tais como leveduras, bolores e dermatófitos.

Portanto, esse meio não pode faltar em um laboratório de microbiologia para investigar a presença de fungos patogênicos ou oportunistas, sejam amostras clínicas ou não clínicas. Também é ideal para o crescimento de bactérias filamentosas como estreptomices e nocardias. Seu uso é muito amplo, pois pode ser usado em micologia humana, animal, vegetal e industrial.

Ágar Sabouraud: fundação, preparação e usos 1

A. Ágar Sabouraud sem sementeira. Agar de Sabouraud semeado com uma levedura. Fonte: Fotos tiradas pelo autor MSc. Marielsa Gil

Esse meio foi criado em 1896 pelo dermatologista líder Raimond Sabouraud, que se tornou um especialista de renome mundial em distúrbios do couro cabeludo, causados ​​principalmente por dermatófitos.

Sua criação foi tão importante que foi utilizada desde então e permanece até hoje, embora com algumas modificações.

Embora seja especial para fungos, as bactérias podem crescer neste meio ; portanto, para amostras com flora mista, é necessária a inclusão de antibióticos em sua preparação e, assim, inibem o crescimento da flora bacteriana que pode estar presente.

O antibiótico deve ser escolhido com cuidado e levando em consideração o tipo de fungo a ser recuperado, pois alguns são inibidos na presença de determinadas substâncias.

Fundação

O ágar Sabouraud dextrose é um meio que, em sua formulação original, é pouco seletivo, devido ao seu pH ácido de 5,6 ± 0,2, porém até mesmo bactérias podem se desenvolver, principalmente em incubações prolongadas.

O meio contém caseína peptona e tecido animal digerido pelo pâncreas, que fornecem a fonte de carbono e nitrogênio para o desenvolvimento de microrganismos.

Ele também contém alta concentração de glicose, que atua como fonte de energia, favorecendo o crescimento de fungos acima das bactérias.Tudo isso misturado com ágar-ágar, um componente que lhe confere a consistência correta.

Por outro lado, o ágar Sabouraud dextrose pode ser seletivo se forem adicionados antibióticos.

Com antibióticos, é especialmente útil em amostras de feridas, úlceras abertas ou qualquer amostra em que haja suspeita de grande contaminação bacteriana.

Combinações mais comumente usadas de ágar Sabouraud dextrose com antibióticos

– Ágar Sabouraud com cloranfenicol: ideal para recuperar leveduras e fungos filamentosos.

-Agar Sabouraud com gentamicina e cloranfenicol: neste ambiente quase todos os fungos e leveduras filamentosas crescem e inibe um grande número de bactérias, incluindo Enterobacteria, Pseudomonas e Staphylococcus.

– Ágar Sabouraud com cicloheximida: é especialmente útil para amostras da pele ou do trato respiratório, desde que a suspeita seja de fungos dimórficos.

A cicloheximida deve ser usada com cautela; Embora seja usado para inibir o crescimento de fungos e leveduras não patogênicos ou ambientais que possam estar presentes como contaminantes em uma amostra, também inibe o crescimento de alguns fungos como Cryptococcus neoformans , Aspergillus fumigatus, Alperchillia boydii, Penicillium sp e outros fungos oportunistas.

– Agar Sabouraud com cloranfenicol mais ciclo-heximida: é usado principalmente para isolar dermatófitos e fungos dimórficos. Tem a desvantagem de inibir algumas espécies de fungos oportunistas como Candida no albicans , Aspergillus, Zigomycetes ou C. neoformans .

– Ágar Sabouraud com cloranfenicol, estreptomicina, penicilina G e ciclo-heximida: é ideal para amostras extremamente contaminadas por bactérias e fungos saprófitos, mas tem a desvantagem de inibir o crescimento de Actinomyces e Nocardias, além dos fungos oportunistas mencionados acima.

Relacionado:  O que são variações fenotípicas?

Preparação

Se os ingredientes estiverem disponíveis separadamente, ele poderá ser preparado da seguinte maneira:

Ágar Sabouraud dextrose

Pesar:

– 40 gr de dextrose

– 10 g de peptona

– 15 g de ágar-ágar

– Meça 1000 ml de água destilada

Todos os ingredientes são misturados, o pH é ajustado para 5,6. Os solutos são dissolvidos por ebulição, 20 ml do meio são distribuídos em tubos de 25 x 150 mm, sem flange e de preferência com uma tampa de algodão.

Ágar Sabouraud: fundação, preparação e usos 2

Tubos com capa de algodão. Fonte: Foto tirada pelo autor MSc. Marielsa Gil

Outros tamanhos de tubo também podem ser usados, dependendo da disponibilidade.

Eles são levados para a autoclave por 10 minutos em uma atmosfera de pressão (121 ° C). Não deve ser excedido no tempo de autoclave.Ao sair da autoclave, os tubos são inclinados com a ajuda de um suporte até solidificar no pico da flauta.

Outra maneira é dissolver os ingredientes aquecendo até ferver. No mesmo tubo de autoclave por 10 minutos e depois distribua 20 ml em placas de Petri.

Se um meio de ágar Sabouraud de dextrose que já contém todos os ingredientes estiver disponível, a quantidade especificada pela empresa comercial para um litro de água é pesada. O restante das etapas são as mesmas descritas acima.

Agar Sabouraud dextrose (modificação de Emmons)

Pesar:

– 20 gr de dextrose

– 10 g de peptona

– 17 g de ágar-ágar

– Meça 1000 ml de água destilada

Todos os ingredientes são misturados, o pH é ajustado para 6,9. Proceda da mesma maneira que no caso anterior.

Existem casas comerciais que oferecem o meio com todos os ingredientes. Nesse caso, pese e prepare conforme descrito na bula.

Agar Sabouraud dextrose (modificação de Emmons) com cloranfenicol

Solução-mãe de cloranfenicol

– Pesar 500 mg de base de cloranfenicol

– Meça 100 ml de etanol a 95%

– misturar

O meio de ágar Sabouraud dextrose (Emmons) é preparado como já descrito e, adicionalmente, para cada litro de meio, adicionar 10 ml de solução-mãe de cloranfenicol antes da autoclave.

Ágar Sabouraud Emmons de dextrose com ciclo-heximida

Solução-mãe de cicloheximida

– Pesar 5 gr de cicloheximida

– Meça 100 ml de acetona

– misturar

O meio de ágar Sabouraud dextrose (Emmons) é preparado como já descrito e, adicionalmente, para cada litro de meio, adiciona-se 10 ml de solução-mãe de ciclo-heximida antes da autoclave.

Agar Sabouraud dextrose (Emmons) com cloranfenicol e ciclo-heximida

O meio de ágar Sabouraud dextrose (Emmons) é preparado como já descrito e, adicionalmente, para cada litro de meio, adicionar 10 ml de solução-mãe de cloranfenicol e 10 ml de solução-mãe de ciclo-heximida antes da autoclave.

Outros antibióticos que podem ser adicionados

20.000 a 60.000 unidades de penicilina por litro de meio.

30 mg de estreptomicina por litro de meio.

Ambos devem ser incorporados após a autoclave do meio, levemente resfriada (50-55 ° C).

Relacionado:  Pelagia noctiluca: características, habitat, reprodução

0,04 g de neomicina por litro de meio.

0,04 g de gentamicina por litro de meio.

Considerações especiais

Por razões de segurança, é preferível semear o ágar Sabouraud dextrose em tubos em forma de cunha (inclinados no pico da flauta) em vez de em placas de Petri, para evitar a dispersão e a inalação de esporos.

É importante que os tubos de ágar Sabouraud estejam tapados com algodão e não com uma tampa de rosca, uma vez que foi demonstrado que condições semi-anaeróbicas inibem a formação de esporos em algumas linhagens, por exemplo, Coccidioides immitis. Além disso, a maioria dos fungos é aeróbica.

No caso de usar a tampa de rosca, não feche bem.

Controle de qualidade

A mídia preparada deve ser verificada quanto à qualidade para verificar seu funcionamento adequado.Para isso, certas cepas de controle são semeadas.

Para o ágar Sabouraud dextrose com cloranfenicol, podem ser utilizadas cepas ATCC de Candida albicans, que devem ter um excelente crescimento. Outra placa é inoculada com cepas de Escherichia coli e deve ser completamente inibida.

Uma placa não inoculada também é incubada na qual nenhum microorganismo deve crescer.

Para o ágar Sabouraud dextrose com cloranfenicol e ciclo-heximida, podem ser utilizadas cepas de Trichophyton mentagrophytes e devem se desenvolver bem. Outra placa é inoculada com uma cepa de Aspergillus flavus , na qual deve haver pouco ou nenhum crescimento. Uma placa não inoculada é incubada para demonstrar esterilidade.

Para o ágar Sabouraud dextrose com cicloheximida, são utilizadas linhagens de Candida albicans, Trichophyton rubrum ou Microsporum canis , que devem demonstrar bom crescimento.

Da mesma forma, é incluída uma cepa de Aspergillus flavus , mostrando pouco ou nenhum crescimento. Finalmente, incube uma placa não inoculada para controle da esterilidade.

Usos

Colheita primária

O ágar Sabouraud dextrose clássico contém 4 g de dextrose e é excelente como principal meio de isolamento, pois mostra a morfologia característica de cada fungo.

Também é excelente para demonstrar a produção de pigmentos. No entanto, não é o meio mais apropriado para observar a esporulação.

Também não é recomendado cultivar Blastomyces dermatitidis, que é inibido pela alta concentração de glicose presente.

Por outro lado, certas considerações devem ser levadas em consideração no cultivo.

Alguns fungos se desenvolvem melhor à temperatura ambiente, como bolores, outros se desenvolvem com sucesso a 37 ° C, como algumas leveduras, e outros podem se desenvolver a ambas as temperaturas (fungos dimórficos).

Portanto, às vezes é necessário usar várias placas de ágar Sabouraud para a mesma amostra, pois elas são frequentemente semeadas em duplicado para incubar uma placa em temperatura ambiente e outra a 37 ° C.

Por exemplo, Sporothrix schenckii é plantado em duas placas; um é incubado à temperatura ambiente para obter a fase do molde e o outro é incubado a 37 ° C para obter a fase levaduriforme, mas no último é necessário adicionar 5% de sangue ao meio.

Em outros casos, como nas amostras de micetomas, são plantadas duas placas de ágar Sabouraud, uma com cloranfenicol e outra com ciclo-heximida. O primeiro permitirá o crescimento de agentes causadores de micetoma micótico (Eumicetoma) e a segunda causa de micetoma bacteriano, como os actinomicetomas.

Relacionado:  Echium vulgare: características, habitat, propriedades, cultivo

Esporulação

O ágar Sabouraud dextrose modificado da Emmons contém 2 g de dextrose e serve não apenas para isolamento, mas também para esporulação e preservação de fungos.

Neste meio, se as cepas de Blastomyces dermatitidis puderem ser recuperadas .

Conservação

Para preservar culturas fúngicas, elas podem ser armazenadas em uma geladeira (2-8 ° C). O tempo de armazenamento pode variar entre 2 a 8 semanas. Após esse período, eles devem ser subcultivados para repetir o processo.

Alguns fungos são mais bem mantidos à temperatura ambiente, como Epidermophyton foccosum, Trichophyton schoenleinnii, T. violaceum e Microsporum audounii .

A manutenção da tensão pode ser prolongada para evitar pleomorfismo se a dextrose do ágar for completamente eliminada e se a quantidade de ágar no meio for reduzida para evitar o ressecamento.

Microculturas

Para a identificação de alguns fungos filamentosos, é necessário realizar microculturas usando o ágar Sabouraud ou outros meios especiais para observar as estruturas da reprodução sexual e assexuada .

Na micologia humana

É utilizado principalmente para o diagnóstico de doenças fúngicas, principalmente aquelas que afetam a pele e seus anexos (cabelos e unhas).

As amostras podem ser secreções, exsudatos, pele, cabelos, unhas, escarro, LCR ou urina. Patógenos comumente isolados são dermatófitos, fungos que causam micoses subcutâneas e sistêmicas.

Micologia animal

Os animais são freqüentemente afetados por infecções fúngicas; portanto, o ágar Sabouraud é tão útil em animais quanto em micologia humana.

Por exemplo, os dermatófitos geralmente podem afetar os animais. É o caso do Microsporum canis var distortum, que freqüentemente infecta cães, gatos, cavalos, porcos e macacos.Da mesma forma , Microsporum gypseum infecta cães, gatos e gado.

Aves como galinhas, galos e galinhas são afetadas por Microsporum gallinae.

Outros fungos, como Zymonema farciminosum, também são causa de doenças em animais, principalmente em cavalos, mulas e burros, causando inflamação significativa nos vasos linfáticos.

Sporothrix schenkii e Histoplasma capsulatum afetam animais domésticos e humanos.

Micologia ambiental

Muitos fungos patogênicos ou oportunistas podem se concentrar a qualquer momento em um determinado ambiente, especialmente em salas de cirurgia e UTIs em clínicas e hospitais. Portanto, é necessário controlá-los.

Outros espaços vulneráveis ​​são bibliotecas e prédios antigos, que podem ser afetados pela concentração de fungos ambientais.

Em estudos ambientais, o ágar Sabouraud dextrose é usado para isolamento de fungos.

Micologia industrial

O ágar Sabouraud dextrose não pode faltar no estudo de fungos contaminantes na produção de cosméticos, alimentos, bebidas, couro, têxteis, entre outros.

Micologia vegetal

As plantas também sofrem de doenças fúngicas, afetando diferentes partes da planta, que podem até terminar a colheita, causando grandes perdas na agricultura.

Referências

  1. Cuenca M, Gadea I, Martín E, Pemán J, Pontón J, Rodríguez (2006). Diagnóstico microbiológico de micoses e estudos de sensibilidade a antifúngicos. Recomendações da Sociedade Espanhola de Doenças Infecciosas e Microbiologia Clínica. Disponível em: coesant-seimc.org
  2. Laboratório ValteK. (2009). Ágar Sabouraud dextrose com ciclo-heximida. Disponível em: andinamedica.com.
  3. Navarro O. (2013). Micologia veterinária Universidade Nacional Agrária. Nicarágua
  4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Diagnóstico microbiológico de Bailey & Scott. 12 ed. Argentina Editorial Panamericana SA
  5. Casas-Rincón G. Micologia Geral. 1994. 2ª Ed. Universidade Central da Venezuela, edições da Biblioteca. Venezuela, Caracas

Deixe um comentário

Este site usa cookies para lhe proporcionar a melhor experiência de usuário. política de cookies, clique no link para obter mais informações.

ACEPTAR
Aviso de cookies