Agar Thayer Martin: fundação, preparação e usos

O ágar Thayer Martin é um meio selectivo altamente nutritivo e sólido para o isolamento de Neisseria meningitidis e Neisseria gonorrhoeae; ambos conhecidos como Neisserias patogênicas ou clinicamente importantes.

Uma das características especiais mais importantes apresentadas pelo ágar Thayer Martin é o seu alto teor em suplementos nutricionais. Essa propriedade é indispensável, pois as Neisserias são microorganismos muito exigentes do ponto de vista nutricional e, portanto, não crescem em meios comuns.

Agar Thayer Martin: fundação, preparação e usos 1

Meio de compras Thayer Martin / ágar Thayer Martin. Fonte Imagem 1: Tirada pelo autor MSc. Marielsa Gil, imagem 2. Pixinio.com ágar bactericolonizado, modificado, Thayer, Martin, ágar.

Por outro lado, como esses microrganismos são normalmente encontrados em áreas não estéreis, é necessária a adição de inibidores que impedem o crescimento da flora associada, sem afetar o desenvolvimento do gênero Neisseria.

Este ágar é composto por ágar à base de GC, hemoglobina, suplementos nutricionais adicionais e um complexo de substâncias inibidoras (antibióticos e antifúngicos). Casas comerciais vendem cada um dos suplementos separadamente.

A amostra a ser semeada neste meio dependerá do microrganismo que está sendo procurado. Para Neisseria gonorrhoeae, as amostras ideais são secreções vaginais e uretrais. Enquanto para Neisseria meningitidis as amostras mais utilizadas são LCR, exsudatos faríngeo e nasofaríngeo.

Fundação

Neisseries são microrganismos classificados como irritantes e, portanto, seu isolamento é difícil. Portanto, o Thayer Martín é um meio complexo e cada um de seus componentes cumpre uma função explicada abaixo:

Ágar-base GC

O ágar GC contém proteína peptona, amido de milho, cloreto de sódio, fosfato dipotássico, fosfato monopotássico e ágar ágar. Seus componentes fornecem os nutrientes básicos para o desenvolvimento microbiano, neutralizam os ácidos graxos tóxicos, contribuem para manter o equilíbrio osmótico, definem o pH e proporcionam consistência sólida ao meio ambiente.

Hemoglobina

A hemoglobina fornece os fatores V e X (nicotinamida adenina dinucleotídeo NAD e hemina, respectivamente). Por esse motivo, as espécies de Haemophilus também crescem nesse ambiente. A hemoglobina pode ser obtida comercialmente na forma desidratada ou o sangue bovino fresco desfibrinado pode ser adicionado ao meio.

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Suplemento enriquecedor

Por outro lado, um complemento de enriquecimento também deve ser adicionado ao meio Thayer-Martin, uma vez que os nutrientes contidos no ágar-base não são suficientes para os requisitos do gênero Neisseria.

O suplemento de enriquecimento mais usado é chamado isovitalex. Contém glutamina, adenina, NAD, cocarboxilase, guanina, nitrato férrico, ácido p-amino benzóico, vitamina B12, tiamina e glicose. Todos esses compostos são necessários para o desenvolvimento adequado de Neisseries patogênicos.

Inibidores

Por ser um meio altamente nutritivo, devem ser utilizados inibidores que impeçam o crescimento de microrganismos da flora usual da região e, assim, favoreçam o isolamento do gênero Neisseria.

O complexo inibidor é composto por vancomicina, colistina e nistatina. A vancomicina inibe o crescimento de bactérias Gram-positivas, a colistina impede o desenvolvimento de bactérias Gram-negativas, como Pseudomonas e algumas Neisserias saprófitas, e a nistatina atua em leveduras como Candida albicans.

No entanto, o ágar Thayer Martin foi modificado; as alterações consistiram na adição de trimetoprim, no aumento da quantidade de ágar e na adição de glicose extra. Essas mudanças melhoraram significativamente a recuperação de espécies de Neisseria gonorrhoeae .

Deve-se notar que o trimetoprim inibe o crescimento do gênero Proteus e sua consequente formação de enxames.Nesse sentido, antibióticos são os que fornecem o caráter seletivo ao médium Thayer Martin.

Preparação

Agar original de Thayer Martin

-Agar GC

Pesar 8,2 g do meio GC desidratado e suspender em 100 ml. Misture e deixe ferver por 1 minuto com agitação frequente para dissolver completamente. Esterilize a mistura em autoclave a 121 ° C por 15 minutos.

-2% de hemoglobina

Suspenda 2 g de hemoglobina desidratada em 2 ou 3 ml de água destilada quente para formar uma mistura uniforme. Adicione mais água pouco a pouco até que um volume de 100 ml esteja completo. A suspensão deve ser homogênea antes da esterilização.

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Esterilize em autoclave por 15 minutos.

Suplemento-enriquecimento

Reconstitua o frasco comercial com o diluente fornecido pela mesma casa comercial. Misture bem. A quantidade de diluente a ser usada será especificada nas instruções do kit.

Suplemento de inibição de CNV (vancomicina, colistina, nistatina)

Reconstitua o frasco com o diluente fornecido pela casa comercial. Misture bem. A quantidade de diluente a ser usada será especificada nas instruções do kit.

-Preparado

Para cada 100 ml de ágar GC, proceda da seguinte forma:

Quando o ágar GC deixar a autoclave, deixe esfriar até uma temperatura aproximada de 50 ° C e adicione 2 ml da solução de hemoglobina preparada, 2 ml do suplemento de enriquecimento (isobitalex ou britalex) e 2 ml do suplemento de inibição. Misture e sirva em placas de Petri estéreis.

Deixe solidificar e guarde na geladeira até o uso.

A cor do meio preparado é vermelho cereja. O pH final do meio é 7,2 ± 0,2

Agar Thayer Martin modificado

Pesar 8,2 g do meio GC desidratado e suspender em 100 ml. Adicione 1 g de ágar-ágar e adicione 0,3 g de glicose. Misture e deixe ferver por 1 minuto com agitação frequente para dissolver completamente. Esterilize a mistura em autoclave a 121 ° C por 15 minutos.

Prepare hemoglobina e suplemento de enriquecimento como descrito acima.

O suplemento de inibição usado é o VCNT (vancomicina, colistina, nistatina, trimetoprim).

-Preparado

Prossiga da maneira descrita para o ágar Thayer Martin original.

Use

O ágar Thayer Martin deve ser temperado antes da semeadura das amostras. As amostras comumente usadas são exsudatos da faringe, exsudatos nasais, secreção vaginal, uretral e / ou retal e LCR.

Use amostras recém-colhidas e faça inóculos fortes no ágar. As amostras são semeadas diretamente por descarga de material e depois estriadas por depleção na superfície.

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As placas são incubadas a 35-37 ° C durante 24 a 48 horas em ambiente microaerofilico frasco (5% CO 2 ). Após o período de incubação, as placas são examinadas em busca de pequenas colônias, cinza e às vezes com aparência de mucoide.

Realize Gram e testes bioquímicos confirmatórios para colônias suspeitas.

Controle de qualidade

As seguintes cepas microbianas podem ser usadas para realizar o controle de qualidade no ágar Thayer Martin.

Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226 e Neisseria meningitidis ATCC 13090; Em ambas as linhagens, espera-se um desenvolvimento satisfatório.

As seguintes cepas também devem ser incluídas: Staphylococcus epidermidis ATCC 14990, Escherichia coli ATCC 25922, Proteus mirabilis ATCC 43071 e Candida albicans ATCC 10231. Em todas elas é esperada uma inibição total ou parcial neste meio.

Limitações

-Você deve ter em mente que as bactérias podem crescer no meio que são resistentes aos inibidores usados.

-Há cepas de Neisseria gonorrhoeae que podem ser sensíveis à concentração de vancomicina usada. Por esse motivo, recomenda-se o uso de agar de chocolate suplementado com isovitalex, mas sem inibidores.

-Há cepas de leveduras resistentes à nistatina que podem crescer nesse ambiente e interferir no isolamento de Neisseries patogênicos, especialmente gonococos.

Referências

  1. Laboratórios de diagnóstico Valtek. Agar Thayer-Martin, 2016 Disponível em: com
  2. Laboratórios britânicos. Thayer Martin Médio Modificado. 2010. Disponível em: britanialab.com
  3. Contribuidores da Wikipedia. Agar Thayer-Martin. Wikipedia, A Enciclopédia Livre. 26 de outubro de 2017 às 16:33 UTC. Disponível em: wikipedia.org4. Acessado em 28 de fevereiro de 2019.
  4. Laboratórios britânicos. Ágar GC. 2010. Disponível em: britanialab.com.
  5. Laboratórios BBL ™ Enriquecimento Médio para Microrganismos Excessivos. 1999. Disponível em: bd.com
  6. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnóstico microbiológico de Bailey & Scott. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentina.

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