Citoquímica: história, objeto de estudo, utilidade e técnicas

A citoquímica , compreende uma série de técnicas que se baseiam na identificação e eliminação de substâncias específicas dentro da célula. É considerado um ramo da biologia celular que combina a morfologia da célula com a estrutura química.

Segundo Bensley, fundador da aplicação da citologia moderna, ele diz que o objetivo da citoquímica é descobrir a organização química das células para entender os mistérios da vida. Além de estudar as mudanças dinâmicas que ocorrem durante os diferentes estágios funcionais.

Citoquímica: história, objeto de estudo, utilidade e técnicas 1

1: Doença extramamária de Paget. (Hematoxilina-Eosina) 2: placas senis observadas no córtex cerebral em um paciente com doença de Alzheimer. (Impregnação com prata) 3: Língua de coelho, fibras de colágeno (azul). Fibras musculares (tiras roxas). (Tricrômico de Masson). 4: Tecido hepático com degeneração gordurosa. (Sudão III) 5: fígado inchado. Necrose (Azul de toluidina) Fontes: Wikipedia. com.br / Usuário: KGH [CC BY-SA 3.0 (http://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0/)[/ Arquivos de domínio público / Mohit Lalwani [CC BY-SA 4.0 (https: // creativecommons. org / licenças / by-sa / 4.0)]

Dessa maneira, é possível determinar o papel metabólico que essas substâncias desempenham na célula.

A citoquímica usa dois métodos principais. O primeiro é baseado em procedimentos químicos e físicos. Essas técnicas usam o microscópio como um instrumento indispensável para visualizar as reações químicas que ocorreram em substâncias específicas dentro da célula.

Exemplo: o uso de corantes citoquímicos, como a reação de Feulgen ou PAS, entre outros.

O segundo método é baseado em bioquímica e microquímica. Com esta metodologia, é possível determinar quantitativamente a presença de substâncias químicas intracelulares.

Entre as substâncias que podem ser evidenciadas em uma estrutura celular ou de tecidos estão as seguintes: proteínas, ácidos nucléicos, polissacarídeos e lipídios.

História da citoquímica

As técnicas citoquímicas desde a sua invenção ajudaram a entender a composição das células e, ao longo do tempo, surgiram várias técnicas que utilizam vários tipos de corantes com diferentes afinidades e fundamentos.

Posteriormente, a citoquímica abriu novos horizontes com o uso de certos substratos para mostrar colorimetricamente a presença de enzimas ou outras moléculas dentro da célula.

Da mesma forma, surgiram outras técnicas, como a imunocitoquímica, que têm sido de grande ajuda para o diagnóstico de muitas doenças. A imunocitoquímica é baseada em reações antígeno-anticorpo.

Por outro lado, a citoquímica também utilizou substâncias fluorescentes chamadas fluorocromos, que são excelentes marcadores para a detecção de certas estruturas celulares. Devido às características do fluorocromo, destaca as estruturas nas quais foi fixado.

Que estuda?

As várias técnicas citoquímicas usadas em uma amostra biológica têm algo em comum: destacar a presença de um tipo específico de substância e conhecer sua localização na estrutura biológica em avaliação, seja um tipo de célula ou um tecido.

Essas substâncias podem ser enzimas, metais pesados, lipídios, glicogênio e grupos químicos definidos (aldeídos, tirosina, etc.).

As informações fornecidas por essas técnicas podem orientar não apenas a identificação de células, mas também o diagnóstico de várias patologias.

Por exemplo, manchas citoquímicas são muito úteis para diferenciar os vários tipos de leucemia, uma vez que algumas células expressam certas enzimas ou substâncias-chave e outras não.

Por outro lado, deve-se notar que, para possibilitar o uso da citoquímica, devem ser consideradas as seguintes considerações:

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1) A substância deve ser imobilizada no local onde é encontrada naturalmente.

2) A substância deve ser identificada usando substratos que reagem especificamente com ela e não com outros compostos.

Utilitário

As amostras que podem ser estudadas através de técnicas citoquímicas são:

– Sangue periférico estendido.

– Medula óssea estendida.

– Tecidos para técnicas histoquímicas.

– Células fixadas por citocentrifugação.

As técnicas citoquímicas são de grande apoio na área da hematologia, pois são amplamente utilizadas para auxiliar no diagnóstico e diferenciação de certos tipos de leucemia.

Por exemplo: As reações à esterase servem para diferenciar entre leucemia mielomonocítica e leucemia monocítica aguda.

Os esfregaços de medula óssea e de sangue periférico desses pacientes se assemelham, uma vez que algumas células são difíceis de identificar apenas do ponto de vista morfológico. Para isso, é realizado o teste de esterase.

No primeiro, esterases específicas são positivas, enquanto no segundo, esterases inespecíficas são positivas.

Eles também são muito úteis em histologia, pois, por exemplo, o uso da técnica de coloração com metais pesados ​​(impregnação argumentativa), mancha as fibras reticulares de cor marrom intensa no tecido miocárdico.

Técnicas em citoquímica

As técnicas mais usadas serão explicadas abaixo:

– Uso de corantes

Os corantes utilizados são muito diversos nas técnicas citoquímicas e podem ser classificados de acordo com vários pontos de vista:

De acordo com o radical pelo qual eles têm afinidade

Eles são divididos em: ácido, básico ou neutro. São os mais simples e os mais utilizados ao longo da história, tornando possível distinguir componentes basofílicos de acidophilus. Exemplo: coloração com hematoxilina-eosina.

Nesse caso, os núcleos das células são corados em azul (eles tomam a hematoxilina, que é o corante básico) e os citoplasmas em vermelho (eles tomam a eosina, que é o corante ácido).

De acordo com a cor que eles fornecem

Eles podem ser ortocromáticos ou metacromáticos. Ortocromáticos são aqueles que mancham as estruturas da mesma cor que o corante. Por exemplo, o caso da eosina, cuja cor é vermelha e tinge de vermelho.

Os metacromáticos, por outro lado, mancham as estruturas de uma cor diferente da deles, como a toluidina, cuja cor é azul e, no entanto, corante violeta.

Corantes vitais ou supravitais

São corantes inofensivos, ou seja, colorem as células e permanecem vivas. Esses corantes são chamados vitais (por exemplo, azul de tripano para manchar macrófagos) ou supravital (por exemplo: Janus verde para manchar mitocôndrias ou vermelho neutro que mancha os lisossomos).

– Detecção de lípidos por meio de corantes lipossolúveis

Tetróxido de ósmio

Corante lipídios (ácidos graxos insaturados) preto. Essa reação pode ser observada com o microscópio óptico, mas como esse corante é de alta densidade, também pode ser visualizado com um microscópio eletrônico.

Sudão III

É um dos mais utilizados. Esse corante se difunde e solubiliza nos tecidos, acumulando-se no interior das gotas de lipídios. A cor é vermelha escarlate.

Sudão manchando B preto

Produz um contraste melhor do que os anteriores, porque também é capaz de se dissolver em fosfolipídios e colesterol. É útil para detectar grânulos de azurofila e específico para granulócitos maduros e seus precursores. Portanto, identifica leucemias mielóides.

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– Coloração de grupos aldeídos (coloração do ácido periódico de Schiff)

A coloração periódica com ácido de Schiff pode detectar três tipos de grupos aldeídos. Eles são:

– Aldeídos livres, naturalmente presentes nos tecidos (reação plasmática).

– Aldeídos produzidos por oxidação seletiva (reação PAS).

– Aldeídos gerados por hidrólise seletiva (reação de Feulgen).

Reação PAS

Essa coloração é baseada na detecção de certos tipos de carboidratos, como glicogênio. O ácido periódico de Schiff quebra as ligações CC dos carboidratos devido à oxidação dos grupos glicólicos 1-2, conseguindo liberar grupos aldeídos.

Os grupos aldeído livre reagem com o reagente de Schiff e formam um composto vermelho-púrpura. A aparência da cor vermelho-púrpura mostra uma reação positiva.

Este teste é positivo em células vegetais, detectando amido, celulose, hemicelulose e pepino. Enquanto nas células animais, ele detecta mucinas, mucoproteínas, ácido hialurônico e quitina.

Além disso, é útil no diagnóstico de leucemias linfoblásticas ou eritroleucemia, entre outras patologias do tipo mielodisplásico.

No caso de carboidratos ácidos, a coloração de azul alciano pode ser usada. O teste é positivo se for observada uma cor azul claro / turquesa.

Reacção plasmática

A reação plasmática mostra a presença de certos aldeídos alifáticos de cadeia longa, como palmital e estearal. Esta técnica é aplicada a cortes histológicos congelados. É tratado diretamente com o reagente de Schiff.

Reação de Feulgen

Esta técnica detecta a presença de DNA. A técnica consiste em submeter o tecido fixo a uma hidrólise ácida fraca e subsequentemente reagi-lo com o reagente de Schiff.

A hidrólise expõe os grupos aldeídos da desoxirribose ao nível da junção desoxirribose-purina. Então, o reagente de Schiff reage com os grupos aldeídos livres.

Essa reação é positiva nos núcleos e negativa nos citoplasmas das células. A positividade é evidenciada pela presença de uma cor vermelha.

Se essa técnica for combinada com metil-verde-pironina, é possível detectar simultaneamente DNA e RNA.

– Manchas citoquímicas para estruturas proteicas

Para isso, pode-se usar a reação de Millon, cujo nitrato de mercúrio é usado como reagente. Estruturas contendo aminoácidos aromáticos serão tingidas de vermelho.

– Manchas citoquímicas que usam substratos para demonstrar a presença de enzimas

Essas manchas são baseadas na incubação da amostra biológica com um substrato específico e o produto da reação reage subsequentemente com sais diazo para formar um complexo colorido.

Esterases

Essas enzimas estão presentes nos lisossomos de algumas células sanguíneas e são capazes de hidrolisar ésteres orgânicos liberando naftol. Este último forma um azocolorante insolúvel quando ligado a um sal diazo, manchando o local onde a reação ocorre.

Existem vários substratos e, dependendo de qual deles é usado, esterases específicas e esterases não específicas podem ser identificadas. Os primeiros estão presentes nas células imaturas da série mielóide e os segundos nas células de origem monocítica.

O substrato usado para a determinação de esterases específicas é: cloroacetato de naftol-AS-D. Embora vários substratos como o acetato de naftol AS-D, o acetato de alfa naftil e o butirato de alfa naftil possam ser utilizados para a determinação de esterases não específicas.

Nos dois casos, as células ficarão vermelhas quando a reação for positiva.

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Mieloperoxidase

Esta enzima é encontrada nos grânulos azurofílicos das células granulocíticas e monócitos.

Sua detecção é usada para diferenciar leucemia mielóide de linfóide. As células contendo mieloperoxidases são de cor ocre amarela.

Fosfatases

Essas enzimas liberam ácidos fosfóricos de diferentes substratos. Eles diferem entre si de acordo com a especificidade do substrato, o pH e a ação de inibidores e inativadores.

Entre as mais conhecidas estão as fosfomonoesrases que hidrolisam os ésteres simples (PO). Exemplo: fosfatase alcalina e fosfatase ácida, bem como fosfonidases que hidrolisam as junções (PN). Estes são utilizados para diferenciar síndromes linfoproliferativas e para o diagnóstico de tricoleucemia.

– Colorações tricrômicas

Tricromo Mallary-Azan

Eles são úteis para diferenciar o citoplasma das células das fibras do tecido conjuntivo. As células estão manchadas de vermelho e as fibras de colágeno, azuis.

Tricrômico de Masson

Isso tem a mesma utilidade que a anterior, mas, neste caso, as células estão manchadas de vermelho e as fibras de colágeno, verdes.

– Corantes que mancham organelas específicas

Janus Green

Isso mancha seletivamente as mitocôndrias.

Sais de prata e ácido osmático

Tinja o aparelho de Golgi.

Azul de toluidina

Corante os corpos de Nissi

Sais de prata e PAS

Mancha as fibras reticulares e a lâmina basal.

Orceína e fucsina resorcinol

Tingir fibras elásticas. No primeiro, são tingidos de marrom e no segundo azul profundo ou roxo.

– Outras técnicas utilizadas em citoquímica

Uso de substâncias fluorescentes ou fluorocromos

Existem técnicas que usam substâncias fluorescentes para estudar a localização de uma estrutura em uma célula. Essas reações são visualizadas com microscópios especiais chamados fluorescência. Exemplo: técnica de IFI (imunofluorescência indireta).

Detecção de componentes celulares por imunocitoquímica

Essas técnicas são muito úteis na medicina, pois ajudam a detectar uma certa estrutura celular e também a quantificá-la. Esta reação é baseada em uma reação antígeno-anticorpo. Por exemplo: técnicas ELISA (Ensaio Imunoenzimático).

Recomendações

– É necessário usar controles de esfregaço para avaliar o bom funcionamento dos corantes.

– Os esfregaços frescos devem ser utilizados para serem submetidos a colorações citoquímicas. Se não for possível, eles devem ser mantidos protegidos da luz e armazenados a 4 ° C.

– Deve-se tomar cuidado para que o fixador utilizado não influencie negativamente a substância a ser investigada. Ou seja, deve-se evitar que seja capaz de extraí-lo ou inibi-lo.

– O tempo de uso dos fixadores deve ser respeitado, pois geralmente deve durar apenas alguns segundos, pois a exposição do esfregaço ao fixador pode danificar algumas enzimas.

Referências

  1. «Cytochemistry.» Wikipedia, A Enciclopédia Livre . 30 de junho de 2018 às 17:34 UTC. 9 jul 2019, 02:53 Disponível em: wikipedia.org
  2. Villarroel P, de Suárez C. Métodos de impregnação metálica para o estudo de fibras reticulares do miocárdio: estudo comparativo. RFM 2002; 25 (2): 224-230. Disponível em: scielo.org
  3. Santana A, Lemes A, Bolaños B, Parra A, Martín M, Molero T. Citoquímica da fosfatase ácida: considerações metodológicas. Rev Diagn Biol. 200; 50 (2): 89-92. Disponível em: scielo.org
  4. De Robertis E, de Robertis M. (1986). Biologia celular e molecular. 11ª edição Editora Athenaeum. Buenos Aires, Argentina.
  5. Ferramentas clássicas para o estudo em biologia celular. TP 1 (material complementar) – Biologia Celular. Disponível em: dbbe.fcen.uba.ar

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