O Wrigth coloração é uma técnica de coloração criado pelo patologista americano James Homer Wright 1902, a partir da mancha Romanowsky. Como a coloração de Romanowsky era instável, Wrigth incorporou o metanol como solvente e fixador.
Essa coloração é policromática, o que significa que gera várias cores, dependendo da estrutura que absorve o corante. Essa técnica de coloração tem sido amplamente utilizada para realizar contagens diferenciais de glóbulos brancos e estudar a morfologia de glóbulos vermelhos, plaquetas e leucócitos no sangue periférico e medula óssea.
Sua aplicação é muito importante, pois podem ser observadas anormalidades nas diferentes linhagens de células sanguíneas, facilitando o diagnóstico de doenças como leucemia ou infecções bacterianas ou parasitárias.
Talvez essas sejam as aplicações mais comuns nas quais essa técnica é usada, mas não são as únicas.Também é útil em amostras que não sejam sangue e medula óssea, como em amostras de secreção nasal, muco fecal, escarro, pele, entre outras.
Fundação de coloração Wright
A coloração de Wright nasceu da coloração de Romanowsky, que consiste em uma solução de álcool metílico de um corante ácido (eosina Y) e um corante básico (azul de metileno) e seus produtos de oxidação.
A mistura de corantes usados na coloração de Wright causa o efeito conhecido como Romanowsky, ou seja, fornece uma linda coloração púrpura aos núcleos leucocitários e aos grânulos neutrofílicos, enquanto os glóbulos vermelhos ficam cor de rosa.
Os componentes responsáveis por fornecer a gama de cores típica da coloração de Wright são azul B e eosina Y. O efeito observado dependerá da ligação dos corantes às estruturas químicas e das interações do azul B e eosina Y.
Estruturas ácidas, como ácidos nucléicos, proteínas nucleares e o citoplasma imaturo reativo de alguns tipos de células, fixam o azul B (corante básico).
Enquanto as estruturas básicas, como a hemoglobina, os grânulos dos eosinófilos segmentados, entre outras estruturas celulares, fixam a eosina Y (corante ácido).
O resultado da coloração pode ser influenciado por diferentes fatores, como o pH do corante Wright, o tampão e a solução de lavagem; bem como o tempo de coloração e fixação.
Portanto, cada etapa da preparação dos reagentes é crucial e deve ser realizada cuidando de todos os detalhes.
Materiais
A coloração de Wright. Para 100 mL é necessário:
Pesar 0,3 g de corante de Wright, medir 97 ml de metanol e 3 ml de glicerol.
Preparação
Em uma argamassa, coloque a quantidade pesada do corante Wright e incorpore gradualmente o glicerol até o pó estar completamente dissolvido.
Posteriormente, o metanol é adicionado, misturado e derramado em uma garrafa de âmbar.
Antes de usar, a solução deve ser agitada com movimentos suaves e filtrada.
Solução tampão tamponada
Em um litro de água destilada dissódico água hidrogenofosfato de 3,76 g (adicionado de Na 2 HPO 4 2H 2 0) ao longo de 2,1 g de di-hidrogenofosfato de potássio (KH 2 PO 4 ).
Misture muito bem até que todos os reagentes incorporados estejam dissolvidos. Ajuste o pH para 7,2. Despeje em uma jarra de vidro e mantenha em temperatura ambiente.
Materiais adicionais necessários para fazer a coloração
Além disso, são necessários outros materiais para executar a técnica de coloração, tais como: lençóis com objetos ou capas, ponte para colorir, camisetas com água ou tampão para lavar roupa, um cronômetro para realizar os tempos de coloração e algum material de secagem (papel absorvente, gaze ou algodão).
Componentes de coloração Wright
Metanol
O álcool (metanol) serve como fixador de esfregaço de sangue na lâmina.
É basicamente um reagente redutor, desidratador e fixador coagulante. Portanto, sua função é coagular as proteínas e torná-las insolúveis, mas sem desnaturá-las.
O metanol é o reagente mais utilizado para corrigir manchas em todos os laboratórios, pois fornece melhores resultados do que os obtidos com o etanol. A concentração ideal é de 99%.
Amortecedor
O tampão (solução tamponada) tem a função de ajustar ou manter o pH do corante, uma vez que um pH ajustado para 7,2 é essencial para que as estruturas celulares possam absorver adequadamente os corantes.
Por outro lado, a etapa de fixação com metanol desidrata as células e o tampão ajuda a reidratá-las.
Eosina (Y)
A eosina tem uma afinidade por componentes básicos porque é um corante ácido. Existem dois tipos de eosina que são muito parecidos entre si, tanto que um deles pode ser usado, obtendo o mesmo resultado.
Uma é chamada eosina Y, eosina amarela ou tetrabromofluoresceína e a outra eosina B, eritrosina azulada B ou dibromodinitrofluoresceína.No entanto, a Eosina Y é a mais utilizada.
A propriedade mais importante desse corante é sua polaridade negativa, o que o atrai por estruturas celulares carregadas positivamente.
Azul de metileno
É o corante básico. Sua principal propriedade é a metacromasia, ou seja, nem todas as estruturas serão tingidas da mesma cor, depende da composição química das estruturas que está colorindo.
Alguns ficam azul claro ou escuro e outros roxo escuro ou lilás claro.
Técnica
1-Realize a propagação da amostra para que ela seja uma película fina, em um slide ou lamínula.
2-Deixe secar ao ar por aproximadamente 2 horas.
3-Coloque a mancha seca na ponte de coloração ou bandeja de coloração com a amostra estendida voltada para cima.
4-Cubra a folha com corante Wright, gota a gota, até cobrir toda a superfície. Deixe por 5 – 8 minutos.
5-O corante deve cobrir completamente a lâmina, sem derramar sobre as bordas. Se durante o período de coloração começar a evaporar, gotas adicionais devem ser colocadas.
6-Subseqüentemente, adicione uma quantidade igual do amortecedor, sopre um pouco até que o brilho metálico característico apareça. Tempo 10 a 15 minutos.
7-Lave com água da torneira, colocando o fluxo macio até que a folha fique rosada.
8-Com uma gaze impregnada de álcool, remova o corante preso na parte de trás da lâmina.
9-Deixe o esfregaço secar muito bem antes de colocar o óleo de imersão para visualizá-lo ao microscópio.
Utilitário
Hematologia
É ideal para a coloração de esfregaços de sangue periférico, para o exame de gota espessa de sangue e para o estudo de células de amostra de medula óssea.
Devido às propriedades químicas dessa combinação de corantes, as estruturas celulares podem ser facilmente reconhecidas, podendo distinguir os diferentes tipos de células presentes.
Secreção nasal
Essa técnica é muito útil para identificar células de secreção nasal (células epiteliais, eosinófilos segmentados, células polimorfonucleares) no diagnóstico de rinite alérgica.
Parasitologia
Nesse sentido, tem sido útil no estudo de Leishmania sp nos histiócitos do tecido celular subcutâneo em úlceras cutâneas.Da mesma forma, é usado para identificar leucócitos em amostras de fezes (leucograma fecal).
Nesse caso, é de interesse do médico saber se a leucocitose presente nas fezes se deve a polimorfonucleares ou mononucleares. Esse achado no leucograma fecal orientará se é uma infecção bacteriana ou viral, respectivamente.
Por outro lado, os parasitas que circulam no sangue podem ser encontrados no interior do eritrócito ou livres no plasma. Os parasitas procurados são Plasmodium spp, Trypanosoma cruzii e filarias, e na medicina veterinária é útil na busca de Theileria equi e Babesia caballi, agentes causadores de bebesiose, principalmente em cavalos.
A cor de Wright e também a de Giemsa permitem diferenciar hemoparasitas dos componentes celulares normais.Para isso, dois tipos de extensões podem ser usados:
Estendido fino
O sangue é espalhado como uma película fina em uma lâmina. Manchado com a mancha de Wright, revelando as características do núcleo e citoplasma.
Gota grossa
Essa metodologia é usada para investigar a presença de parasitas em uma quantidade maior de sangue.
Para isso, uma grande gota de sangue é colocada em um slide. Uma vez lá, ele deve ser desfibrinado, fazendo círculos cada vez maiores do centro para o exterior, usando a borda de outro slide.
Finalmente, para observar os parasitas no esfregaço espesso, os eritrócitos devem ser lisados com água.
Infecções respiratórias
No nível respiratório, essa técnica também é útil, pois as células presentes nas amostras de escarro, lavagem brônquica ou broncoalveolar, são importantes para estabelecer o diagnóstico.
Da mesma forma, células polimorfonucleares e células mononucleares podem ser distinguidas aqui.
Bacteriologia
O uso dessa técnica em bacteriologia é limitado, porque não é bom para a coloração de bactérias, razão pela qual outras técnicas especializadas de coloração são utilizadas para colorá-las.
No entanto, tem sido utilizado para procurar células epiteliais com corpos de inclusão de Chlamydia trachomatis em esfregaços de mucosa uretral ou endocervical, embora seja necessário reconhecer que não é o melhor método para isso.
Também é possível observar entre as bactérias do tipo espiral dos glóbulos vermelhos, como Borrelia burgdorferi, em pacientes infectados, bem como mórulas ou corpos de inclusão de Ehrlichia sp no citoplasma de linfócitos, monócitos ou neutrófilos em um esfregaço de sangue.
Micologia
O Histoplasma capsulatum é um fungo patogénico frequentemente diagnosticado por observação microscópica de várias amostras de tecido, coradas com Wright da mancha.
Como as estruturas da amostra de sangue são observadas com a coloração de Wright?
Recomendações para uma boa coloração
Extensões de amostras de sangue devem secar espontaneamente. Os esfregaços devem ser o mais finos possível para obter uma melhor fixação do corante e evitar colorações excessivas.
Para o tingimento de alta qualidade, é aconselhável realizar a coloração durante as duas horas após a preparação do esfregaço.Por outro lado, a amostra ideal é o sangue capilar, sem anticoagulante.
No entanto, se o sangue venoso for usado, ele deve ser usado como anticoagulante EDTA e não heparina, uma vez que este último pode deformar estruturas celulares.
Para evitar a deterioração do corante preparado, ele deve ser armazenado em locais secos.
Durante o processo de lavagem, recomenda-se o uso de água ajustada ao pH neutro.
Finalmente, é aconselhável testar os métodos de tingimento utilizados em laboratório de tempos em tempos.
Isso é feito com tingimento de amostras ou padrões estendidos, como controle de qualidade. Essa etapa é importante, pois garante que a coloração seja preparada adequadamente e que os tempos de coloração sejam bem padronizados.
Se a folha de padrões estiver mal colorida, existem problemas que devem ser resolvidos.
Erros comuns na coloração de Wrigth
Coloração muito pálida
Manchas muito pálidas são geralmente devidas a um tempo de coloração muito curto ou a uma lavagem muito exagerada. Isso é corrigido aumentando o tempo de contato com o corante ou reduzindo o tempo de lavagem.
Corantes precipitados
A presença de precipitados de corante no esfregaço pode ter várias causas, no entanto, as causas mais frequentes são: uso de corante não filtrado, corante em pontes de cores desiguais, uso de lençóis sujos com poeira ou graxa, não faça uma boa lavagem Termine a coloração.
Mancha com coloração extremamente avermelhada ou azul
O tampão é responsável pelo pH do corante. Corantes com pH abaixo do indicado (ácido) resultam em manchas muito avermelhadas.
Se o pH do corante estiver acima (alcalino), será obtido um esfregaço extremamente azulado.
Modo de armazenamento
O reagente deve ser armazenado à temperatura ambiente.
Referências
- Gutierrez V. Estudo comparativo entre o método de coloração de Wright e o teste de Elisa para o diagnóstico de erliquiose canina na cidade de San Pedro Sula, Honduras. 2008. Tese de graduação para se qualificar para o Grau de Medicina Veterinária. Universidade de San Carlos da Guatemala.
- López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. As manchas básicas no laboratório de microbiologia. Pesquisa sobre Deficiência. 2014; 3 (1): 10-18.
- “Coloração de Wright.” Wikipedia, A enciclopédia livre . 18 de maio de 2018 às 12:05 UTC. 8 de dezembro de 2018, 20:37 <https://es.wikipedia.org.
- Calderón A, Cardona J, Vergara Ó. Frequência de Babesia spp . em cavalos de montería, Córdoba (Colômbia). Rev. udcaactual divulg cient . 2013; 16 (2): 451-458.
- Forbes B, Sahm D, Weissfeld A (2009). Diagnóstico microbiológico de Bailey & Scott. 12 ed. Argentina Editorial Panamericana SA
- Retamales E, Mazo V. Instituto de Governo em Saúde Pública do Chile. Recomendações para manchas de sangue para leitura de hemograma.