A coloração Giemsa é uma técnica utilizada em microbiologia e citogenética para corar células e tecidos, permitindo a visualização de estruturas específicas. Desenvolvida por Gustav Giemsa em 1904, a coloração Giemsa é uma das técnicas mais utilizadas em laboratórios de diagnóstico para identificar microorganismos, parasitas e cromossomos.
Para realizar a coloração Giemsa, são necessários materiais como o corante Giemsa, metanol e água destilada. A técnica envolve a fixação das células em lâminas de vidro, seguida da aplicação do corante Giemsa diluído em metanol. Após a coloração, as células são lavadas em água destilada e observadas ao microscópio.
Os principais usos da coloração Giemsa incluem a identificação de agentes patogênicos como Plasmodium (causador da malária), Trypanosoma (causador da doença de Chagas) e bactérias como Chlamydia e Rickettsia. Além disso, a coloração Giemsa é amplamente utilizada na análise de cromossomos para diagnosticar doenças genéticas e identificar alterações cromossômicas.
Passo a passo para realizar a coloração de Giemsa de forma eficaz.
A coloração de Giemsa é uma técnica essencial em laboratórios de análises clínicas e pesquisa científica. Ela permite a visualização de diferentes estruturas celulares, como cromossomos, parasitas e bactérias, através da coloração específica de suas componentes. Neste artigo, vamos explicar passo a passo como realizar a coloração de Giemsa de forma eficaz.
Passo 1: Prepare uma solução de Giemsa, que pode ser adquirida pronta ou preparada a partir do pó. A solução deve ser diluída em água destilada na proporção recomendada pelo fabricante.
Passo 2: Fixe a amostra em uma lâmina de vidro utilizando calor ou substâncias fixadoras, como álcool etílico. Certifique-se de que a amostra esteja bem fixada para evitar distorções durante a coloração.
Passo 3: Cubra a amostra fixada com a solução de Giemsa, garantindo que toda a superfície seja coberta de forma uniforme. Deixe a lâmina em contato com a solução por um período de tempo específico, geralmente entre 10 e 30 minutos.
Passo 4: Enxágue a lâmina com água corrente para remover o excesso de corante. Seque a lâmina delicadamente com papel absorvente ou ar comprimido.
Passo 5: Observe a amostra colorida ao microscópio óptico utilizando objetivas de aumento adequadas. A coloração de Giemsa irá permitir a visualização de estruturas celulares com maior clareza e contraste.
A coloração de Giemsa é amplamente utilizada em diversas áreas da biologia e da medicina, como no diagnóstico de doenças parasitárias, na análise de células sanguíneas e na identificação de agentes infecciosos. Seguindo corretamente os passos descritos acima, é possível obter resultados precisos e confiáveis na coloração de Giemsa.
Entenda o processo de coloração de Giemsa e seu funcionamento em detalhes.
A coloração de Giemsa é um método amplamente utilizado em laboratórios de microbiologia e hematologia para visualização de estruturas celulares e detecção de agentes patogênicos. Desenvolvido por Gustav Giemsa em 1902, esse método é baseado na afinidade de corantes básicos e ácidos com diferentes componentes celulares.
Os materiais necessários para realizar a coloração de Giemsa incluem o corante Giemsa, soluções de fixação e descoloração, lâminas, lamínulas e microscópio. O corante Giemsa é uma mistura de azul de metileno, eosina e glicerina, e é utilizado para corar estruturas nucleares e citoplasmáticas das células.
A técnica de coloração de Giemsa envolve a fixação das células em uma lâmina, seguida da aplicação do corante Giemsa por um determinado tempo. Após a coloração, as células são lavadas com água destilada e descoloridas para remover o excesso de corante. Por fim, as lâminas são secas e observadas ao microscópio.
Os principais usos da coloração de Giemsa incluem a identificação de parasitas sanguíneos, como Plasmodium spp., e a diferenciação de células sanguíneas em esfregaços de sangue periférico. Além disso, esse método é amplamente utilizado na identificação de bactérias, vírus e outros agentes patogênicos em amostras clínicas.
Seu funcionamento é baseado na afinidade de corantes básicos e ácidos com diferentes componentes celulares, proporcionando imagens nítidas e detalhadas ao microscópio.
Entenda o procedimento de anatomia patológica com coloração Giemsa para análise clínica.
A coloração Giemsa é uma técnica utilizada em anatomia patológica para análise clínica de amostras de tecidos. Desenvolvida pelo cientista alemão Gustav Giemsa, essa coloração é amplamente utilizada devido à sua capacidade de destacar diferentes componentes celulares, como núcleos, cromossomos e parasitas.
Para realizar a coloração Giemsa, são necessários alguns materiais, como o corante Giemsa, álcool metílico, solução salina e lâminas de vidro. O procedimento envolve a fixação da amostra em álcool metílico, seguida da aplicação do corante Giemsa e da lavagem com solução salina. Após a coloração, as amostras são observadas ao microscópio para análise.
A coloração Giemsa é amplamente utilizada em laboratórios de anatomia patológica para a identificação de diferentes patologias, como infecções parasitárias, leucemias e doenças autoimunes. A técnica permite uma análise detalhada das estruturas celulares, facilitando o diagnóstico clínico e o acompanhamento do tratamento.
Seu uso é fundamental para o diagnóstico e tratamento de diversas doenças, tornando-se uma técnica indispensável para profissionais da área da saúde.
Identificação do corante utilizado na coloração de um esfregaço sanguíneo.
A coloração de Giemsa é um método comum utilizado para observar diferentes tipos de células sanguíneas em um esfregaço sanguíneo. O corante principal utilizado nesse processo é o corante Giemsa, que é uma mistura de azul de metileno, eosina e azur B. Esse corante é especialmente eficaz na coloração de estruturas como os núcleos das células, cromossomos e inclusões citoplasmáticas.
Coloração Giemsa: fundação, materiais, técnica e usos
O corante de Giemsa é um tipo de coloração de amostras clínicas, com base na mistura de corantes ácidos e básicos. Sua criação foi inspirada no trabalho de Romanowsky, onde Gustav Giemsa, químico e bacteriologista da Alemanha, o aperfeiçoou adicionando glicerol para estabilizar os compostos.
As alterações geradas na técnica original de Romanowsky nos permitiram melhorar consideravelmente as observações microscópicas; portanto, a técnica foi denominada coloração de Giemsa.
Por ser uma técnica simples de executar, altamente funcional e econômica, atualmente é amplamente utilizada no laboratório clínico para esfregaços hematológicos, amostras de medula óssea e seções de tecidos.
A técnica de coloração por Giemsa é muito útil para estudos citológicos, pois permite a observação de estruturas celulares específicas.Essa técnica mancha os citoplasmas, núcleos, nucléolos, vacúolos e grânulos das células, sendo capaz de distinguir traços finos de cromatina.
Além disso, podem ser detectadas alterações significativas no tamanho, forma ou coloração do núcleo, onde é possível visualizar a perda da relação núcleo-citoplasma.
Por outro lado, permite identificar células imaturas na medula óssea e no sangue periférico, sendo importante para o diagnóstico de doenças graves como a leucemia. Também é possível detectar hemoparasitas, bactérias extras e intracelulares, fungos, entre outros.
Na citogenética, é amplamente utilizado, pois é possível estudar a mitose das células.
Fundação de coloração Giemsa
Os corantes do tipo Romanowsky baseiam-se no uso de um contraste entre os corantes ácidos e básicos, para colorir as estruturas básicas e ácidas, respectivamente. Como pode ser visto, existe uma afinidade dos corantes ácidos para manchar as estruturas básicas e vice-versa.
O corante básico usado é o azul de metileno e seus derivados oxidados (Azure A e Azure B), enquanto o corante ácido é a eosina.
As estruturas ácidas das células são ácidos nucleicos, grânulos de basófilos segmentados, entre outros, para que sejam corados com azul de metileno.
Nesse mesmo sentido, as estruturas básicas das células são a hemoglobina e alguns grânulos, como os contidos nos eosinófilos segmentados, entre outros; Estes serão tingidos com eosina.
Por outro lado, como o azul de metileno e o azul celeste são caracterizados como corantes metacromáticos, eles podem fornecer um tom variável às diferentes estruturas de acordo com a carga de polianiões que possuem.
É assim que a combinação estratégica de corantes básicos e ácidos consegue desenvolver um amplo espectro de cores, de acordo com as características bioquímicas de cada estrutura, passando por tons de azul pálido, azul escuro, lilás e roxo no caso de estruturas ácidas.
Enquanto a cor fornecida pela eosina é mais estável, gera cores entre laranja avermelhado e salmão.
Materiais
Materiais para a preparação da solução-mãe
A preparação da solução-mãe requer pesar 600 mg de corante em pó Giemsa, medindo 500 ml de álcool metílico sem acetona e 50 ml de glicerina neutra.
Modo de preparação da solução-mãe
Coloque o pó pesado de Giemsa em uma argamassa. Se houver caroços, eles devem ser pulverizados. Em seguida, adicione uma quantidade apreciável da glicerina medida e misture muito bem. A mistura obtida é vertida em um frasco âmbar muito limpo.
O restante da glicerina é colocado na argamassa. Misture novamente para limpar o restante corante que foi colado nas paredes da argamassa e coloque na mesma garrafa.
A garrafa é coberta e transportada por 2 horas em banho-maria a 55 ° C.Enquanto estiver em banho-maria, mexa levemente a mistura a cada meia hora.
Posteriormente, a mistura é deixada esfriar para colocar o álcool. Anteriormente, uma parte do álcool medido é colocada na argamassa para terminar de lavar o corante restante e depois adicionada à mistura junto com o restante do álcool.
Esta preparação deve deixar amadurecer por pelo menos 2 semanas. A parte usada na solução-mãe deve ser filtrada.
Para evitar a contaminação da preparação, recomenda-se passar a parte que estará em uso constante para uma pequena garrafa de âmbar com conta-gotas. Reabasteça cada vez que o reagente estiver esgotado.
Materiais para preparar a solução tampão
Por outro lado, uma solução tampão a pH 7,2 é preparada da seguinte maneira:
6,77 g de fosfato de sódio (anidro) (pesava NaHPO 4 ), 2,59 g de di-hidrogenofosfato de potássio (KH 2 PO 4 ), e água destilada até 1000 ml.
Preparação final do corante
Para a preparação da solução final de coloração, medem-se 2 ml da solução-mãe filtrada e misturam-se com 6 ml da solução tampão. A mistura é agitada.
Um fato relevante que deve ser levado em consideração é que as técnicas de preparação de corantes podem mudar de acordo com a instalação comercial.
Materiais adicionais necessários para fazer a coloração
Além dos materiais descritos, deve haver pontes coloridas, camisetas com água ou tampão para lavar roupa, lençóis com objetos ou capas, um cronômetro para controlar o tempo de coloração e borrar o papel ou algum material que sirva para secar ( gaze ou algodão).
Técnica
Processo de coloração
1) Antes da coloração, a amostra deve ser espalhada em uma lâmina limpa.
As amostras podem ser sangue, medula óssea, cortes de tecido histológico ou amostras cervical-vaginais. Recomenda-se que as pastas sejam finas e tenham 1 ou 2 horas de secagem antes da coloração.
2) Em uma ponte para colorir são colocadas todas as folhas que têm cor. Sempre funciona na mesma ordem e cada folha está bem identificada.
3) Coloque algumas gotas de álcool metílico a 100% (metanol) no esfregaço e deixe por 3 a 5 minutos para fixar e desidratar a amostra.
4) Descarte o metanol presente na folha e deixe secar ao ar.
5) Depois de seco, coloque a solução final de coloração com um conta-gotas até que toda a folha esteja coberta. Deixe por 15 minutos. Alguns autores recomendam até 25 min. Depende da casa comercial.
6) Drene o corante e lave o esfregaço com água destilada ou com uma solução tampão em 7.2.
7) Em papel absorvente, deixe as folhas secar ao ar livre, dispostas verticalmente com a ajuda de um suporte.
8) Limpe a parte de trás da lâmina com uma gaze ou cotonete embebido em álcool para remover qualquer corante.
Utilitários
A técnica de coloração Giemsa é usada em várias áreas, incluindo: hematologia, micologia, bacteriologia, parasitologia, citologia e citogenética.
Hematologia
É o utilitário mais frequente dado a essa coloração. Com ele, todas e cada uma das células presentes na medula óssea ou em amostras de sangue periférico podem ser identificadas. Além de estimar o número de cada série, é possível detectar leucocitose ou leucopenia, trombocitopenia, etc.
Por ser sensível à identificação de células imaturas, é relevante no diagnóstico de leucemia aguda ou crônica. Também é possível fazer o diagnóstico de anemias, como doença falciforme, doença falciforme, entre outras.
Micologia
Nesta área, é comum o uso de Histoplasma capsulatum (fungo dimórfico intracelular) em amostras de tecido.
Bacteriologia
Em esfregaços hematológicos corados com Giemsa, é possível detectar Borrelias sp em pacientes com a doença chamada febre recorrente. Os espiroquetas são abundantemente observados entre os eritrócitos, em amostras colhidas no pico febril.
Também é possível visualizar bactérias intracelulares como Rickettsias sp e Chlamydia trachomatis em células infectadas.
Parasitologia
No campo da parasitologia, a coloração de Giemsa permitiu o diagnóstico de doenças parasitárias como malária, doença de chagas e leishmaniose.
Nos dois primeiros parasitas, Plasmodium sp e Trypanosoma cruzi, respectivamente, podem ser visualizados no sangue periférico de pacientes infectados, podendo ser encontrados em vários estágios de acordo com o estágio em que a doença se encontra.
Para melhorar a busca de parasitas no sangue, recomenda-se o uso da mancha Giemsa misturada ao corante May-Grünwald.
Da mesma forma, a leishmaniose cutânea pode ser diagnosticada através da avaliação de amostras de biópsias de pele coradas com Giemsa, onde o parasita é encontrado.
Citologia
A coloração de Giemsa também é usada para o estudo citológico de amostras endocervicais, embora não seja a técnica mais utilizada para esse fim.
Porém, nos casos de escassez de recursos, ele pode ser usado, com uma funcionalidade semelhante à oferecida pelo exame de Papanicolaou e a um custo menor. No entanto, requer conhecimentos do examinador.
Citogenética
Uma característica relevante da coloração de Giemsa é sua capacidade de se ligar fortemente às regiões do DNA ricas em adenina e timina. Isso permite que o DNA seja visualizado durante a mitose das células, em diferentes estados de condensação.
Esses estudos são necessários para detectar aberrações cromáticas, como duplicações, deleções ou translocações das diferentes regiões dos cromossomos.
Pesquisa demonstrando a eficácia da coloração Giemsa
Cannova et al (2016), compararam três técnicas de coloração para o diagnóstico de leishmaniose cutânea.
Para isso, foram utilizadas amostras obtidas de um animal experimental ( Mesocrisetus auratus) inoculado experimentalmente com Leishmanias.
Os autores demonstraram que a coloração Giemsa foi melhor que a coloração Pap-mart® e Gaffney. Portanto, consideraram que a coloração por Giemsa é ideal para o diagnóstico de leishmaniose cutânea.
Os excelentes resultados obtidos pelos autores devem-se ao fato de a combinação de corantes que compõem a mistura Giemsa possuir as condições necessárias para criar um contraste favorável, possibilitando distinguir claramente as estruturas dos amastigotas, tanto intra como extracelularmente.
As outras técnicas (Pap-mart® e Gaffney) também fizeram isso, mas de uma maneira mais fraca e, portanto, mais difícil de visualizar.É por isso que a coloração de Giemsa é recomendada para o diagnóstico parasitológico da leishmaniose.
Da mesma forma, um estudo de Ramírez et al (1994) avaliou a validade das manchas de Giemsa e Lendrum em esfregaços conjuntivais para a identificação de Chlamydia trachomatis.
Os autores determinaram que as colorações de Giemsa e Ledrum têm a mesma especificidade, mas Giemsa provou ser mais sensível.
Isso explica por que a coloração com Giemsa é atualmente a mais frequentemente usada para o diagnóstico de infecções por clamídia, especialmente se houver poucos recursos.
Recomendações para uma boa coloração
A secagem das folhas não deve ser acelerada. Você deve esperar o tempo prudente para secá-lo ao ar livre. Aproximadamente 2 horas
Cor imediatamente após 2 horas para obter melhores resultados.
Para que as manchas sejam fixadas e manchadas melhor, a amostra deve ser distribuída na folha de maneira a deixar uma camada fina e uniforme.
A amostra de sangue preferida é o capilar, pois o esfregaço é feito diretamente da gota de sangue e, portanto, a amostra não possui nenhum aditivo, o que favorece a manutenção das estruturas celulares.
No entanto, se o sangue venoso for utilizado, o EDTA deve ser usado como anticoagulante e não como heparina, uma vez que o último geralmente deforma as células.
Erros comuns na coloração de Giemsa
Na prática dessa coloração, erros podem ser cometidos. Eles são evidenciados por mudanças repentinas nas tonalidades das estruturas.
Coloração extremamente azul
Pode ser devido a:
- Manchas muito grossas
- Exceder o tempo de coloração
- Lave insuficientemente.
- Uso de reagentes bem acima do pH neutro (alcalino).
Sob essas condições, as cores das estruturas a seguir são distorcidas, de modo que os eritrócitos, em vez de morrerem de salmão rosa, ficarão verdes, os grânulos de eosinófilos que devem ser tingidos de tijolo vermelho ficarão azulados ou cinza e assim por diante. desvio nas tonalidades usuais.
Coloração excessivamente rosa
Pode ser devido a:
- Tempo de coloração insuficiente.
- Lavagem prolongada ou excessiva.
- Pouco seco
- Uso de reagentes muito ácidos.
Nesse caso específico, as estruturas que normalmente são tingidas de azul não serão quase visíveis, enquanto as estruturas que são tingidas de rosa terão tons muito exagerados.
Exemplo: os eritrócitos terão uma cor vermelha brilhante ou laranja forte, a cromatina nuclear parecerá rosa pálido e os grânulos de eosinófilos mancharão um vermelho brilhante.
Presença de precipitados no esfregaço
As causas podem ser:
- Use lençóis sujos ou mal lavados.
- Não deixe a mancha secar bem.
- Deixe a solução fixadora por muito tempo.
- Lavagem inadequada no final da coloração.
- Filtragem inadequada ou nenhuma filtragem do corante sendo usado.
Presença de artefatos morfológicos
Nas manchas, podem aparecer artefatos morfológicos que dificultam a visualização e a interpretação das estruturas. Isto é porque:
- Tipo de anticoagulante usado, como heparina.
- Uso de folhas sujas, danificadas ou oleosas.
Modo de armazenamento
Após a preparação, o corante deve ser mantido à temperatura ambiente (15-25 ° C), para evitar a precipitação do corante. Deve ser armazenado em um recipiente âmbar bem fechado.
Referências
- Cannova D, Brito E e Simons M. Avaliação de técnicas de coloração para o diagnóstico de Leishmaniose cutânea. Salus . 2016; 20 (2): 24-29.
- PanReac Applichem Reagents ITW. Coloração Giemsa. Versão 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Espanha.
- Clark G. Staining procedures (1981), 4º. Williams & Willkins.
- Química Clínica Aplicada. Corante Giemsa para diagnóstico in vitro . Distribuidor: cromakit.es
- Ramírez I, Mejía M, García de la Riva J, Hermes F e Grazioso C. Validade das manchas de Giemsa e Lendrum em esfregaços conjuntivais para a identificação de Chlamydia trachomatis. Tigela de Sanit Panam. 1994; 116 (3): 212-216.
- Casas-Rincón G. Micologia Geral. 1994. 2ª Ed. Universidade Central da Venezuela, edições da Biblioteca. Venezuela, Caracas
- «Coloração de Giemsa.» Wikipedia, A enciclopédia livre . 1 de setembro de 2017 às 01:02 UTC. 6 de dezembro de 2018, en.wikipedia.org.