Mancha de Gram: fundação, materiais, técnica e usos

A coloração de Gram é coloração técnica mais simples e mais útil de diagnóstico, em microbiologia. Essa técnica foi criada pelo médico dinamarquês Hans Christian Gram em 1884, que conseguiu classificar as bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, de acordo com a composição da parede celular .

A técnica passou por certas modificações por Hucker em 1921 para estabilizar os reagentes e melhorar a qualidade da coloração, de modo que a coloração de Gram também é conhecida como Gram-Hucker.

Mancha de Gram: fundação, materiais, técnica e usos 1

Vários estendidos corados com coloração de Gram. A. Cocos Gram-positivos. B. Bacilos Gram-negativos. C. Gram positivo, bacilos polimorfonucleares e mononucleares. D. Leveduras

Com esta técnica também é possível observar a forma dos microrganismos, ou seja, se são cocos, bacilos, cocobacilos, pleomórficos, filamentosos, entre outros. Assim como sua distribuição no espaço: em cluster, em cadeia, isolado, em pares, em tetrades, etc.

Quando houver suspeita de infecção bacteriana, a maioria das amostras recebidas deve ser espalhada na lâmina e corada com Gram para ser examinada ao microscópio.

O relatório Gram orientará o médico sobre que tipo de microorganismo pode ser a causa da infecção, antes de obter o resultado definitivo da cultura.

Em alguns casos, a vida do paciente é muito comprometida; portanto, os médicos precisam urgentemente do relatório Gram para realizar um tratamento empírico, enquanto aguardam a identificação do microorganismo.

Por exemplo, se o Gram revelar que há cocos Gram-positivos no líquido cefalorraquidiano, o médico orientará a terapia inicial com antibióticos que eliminam esse tipo de bactéria, de acordo com os protocolos estabelecidos.

Quando o resultado final chegar com o nome do microrganismo isolado e seu respectivo antibiograma, o médico avaliará se deve ou não alterar a terapia. Esta decisão será tomada de acordo com o estudo de suscetibilidade do microrganismo aos antibióticos que está recebendo e a evolução do paciente.

Fundação

Esta é uma técnica que apresenta 4 etapas fundamentais: coloração, fixação com mordente, descoloração e contratação. Portanto, além de colorir as bactérias, essa técnica também permite diferenciação.

O cristal violeta é o primeiro corante usado. Tem uma afinidade pelo peptidoglicano e manchará todas as bactérias presentes em púrpura; em seguida, colocará o lugol, que age como mordente, ou seja, induzirá a formação de complexos insolúveis de cristal violeta-iodo – proteínas ribonucleares no interior da célula. .

Bactérias gram-positivas, com uma parede peptidoglicana espessa, formam mais complexos (cristal violeta-iodo), retendo o corante.

Além disso, também influencia que a parede das bactérias Gram-positivas contenha uma quantidade maior de ácidos insaturados, que mostram grande afinidade pelos agentes oxidantes (Lugol).

Enquanto isso, as bactérias Gram-negativas têm uma fina camada de peptidoglicano, que faz com que as bactérias se formem menos complexas que as Gram-positivas.

Depois vem a etapa da descoloração, onde as bactérias Gram-positivas e Gram-negativas se comportam de maneira diferente.

As bactérias gram-negativas contêm uma membrana externa rica em lipopolissacarídeos que faz parte de sua parede celular. As gorduras são destruídas pelo contato com o álcool acetona, de modo que a membrana externa é desestabilizada e o cristal violeta é liberado.

É assim que ele é contrastado com a safranina ou fucsina básica, assumindo a cor vermelha.

No caso das bactérias Gram-positivas, elas resistem ao desbotamento porque o alvejante age fechando os poros, o que impede que o complexo de cristal violeta / iodo saia.

Portanto, a coloração com o cristal violeta permanece estável e não há lugar para safranina ou fucsina. É por isso que essas bactérias mancham azul profundo ou roxo.

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Materiais

O conjunto de colorir Gram é composto por:

  • Violeta cristal
  • Lugol
  • Álcool acetona
  • Safranina ou fucsina básica

Preparação de corantes e reagentes

Solução de cristal violeta

Solução A:

Cristal violeta – 2 – 2 gr

Álcool etílico a 95% —————————— 20cc

Solução B:

Oxalato de amônio ——————————— 0.8 gr

Água destilada ———————————— 80 cc

Para a preparação final do cristal violeta, a solução A 1:10 deve ser diluída com água destilada e misturada com 4 partes da solução B. A mistura é armazenada por 24 horas antes do uso. Filtrar em uma garrafa para manchas de âmbar usando um filtro de papel.

A quantidade a ser usada diariamente é transferida para uma garrafa de âmbar com conta-gotas.

Iodo-Lugol

Pesar e medir a quantidade indicada de cada composto, como a seguir:

Cristais de Iodo ——— 1gr

Iodeto de potássio – 2 – 2gr

Água destilada ———————————— 300 cc

O iodeto de potássio é dissolvido pouco a pouco na água e, posteriormente, o iodo é adicionado. A solução é raspada em uma garrafa de âmbar.

A quantidade a ser usada diariamente é transferida para um frasco âmbar menor com conta-gotas.

Branqueamento

Álcool etílico a 95% ——————————— 50 ml

Acetona ————————————————-

É preparado em partes iguais. Cubra bem, ele tende a evaporar.

Coloque no pote com conta-gotas.

Esta preparação fornece uma descoloração em tempo moderado de 5 a 10 segundos e é a mais recomendada.

Iniciantes preferem usar apenas álcool etílico a 95%, onde a descoloração é mais lenta de 10 a 30 segundos.

Enquanto os mais experientes podem usar acetona pura, onde o desbotamento ocorre muito rapidamente por 1 a 5 segundos.

Contraste

Solução-mãe de safranina

Safranina ————————————— 2.5 gr

Álcool etílico a 95% ————————– 100 cc

Após a pesagem, a quantidade indicada de safranina é dissolvida em 100 ml de álcool etílico a 95%.

A solução de safranina de trabalho é preparada a partir da solução de estoque.

Para fazer isso, meça 10 cm da solução padrão e adicione 90 cm de água destilada para completar 100 ml.

Recomenda-se transferir a quantidade a ser usada diariamente para uma garrafa de âmbar com conta-gotas.

Os microrganismos de coloração Gram-negativos com Gram-Hucker, como certos anaeróbios, Legionella sp, Campylobacter sp e Brucella sp , podem ser corados muito melhor se a modificação de Kopeloff à coloração Gram-Hucker for usada, chamada coloração de Gram-Kopeloff.

Essa técnica altera o corante safranina para fucsina básica. Com esta modificação, é possível colorir efetivamente os microrganismos mencionados acima.

Armazenamento de reagentes

Os corantes preparados devem ser armazenados em temperatura ambiente.

Preparação da amostra estendida para colorir

Uma amostra deve conter pelo menos 10 5 microrganismos antes que seja provável a observação do microrganismo em um esfregaço.As propagações podem ser feitas a partir da amostra direta ou de culturas em meio sólido ou líquido.

As estendidas devem ser uniformes, bem distribuídas e não muito grossas, para melhor visualização das estruturas presentes.

-Gram de amostras diretas

Grama de urina sem girar

A urina é misturada e 10 µl são colocados em uma lâmina. A observação de pelo menos um campo de bactéria / imersão indica infecção.

Isto significa que a cultura terá aproximadamente 100,000 CFU / ml (10 5 CFU / ml) de urina em 85% dos casos.

Este método não é útil para contagens de colônias abaixo de 100.000 UFC.

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Grama no LCR

O LCR deve ser centrifugado, o sobrenadante é removido e o sedimento é espalhado em uma lâmina. Este líquido é estéril em condições normais; A observação de bactérias indica infecção.

Grama de amostras respiratórias

Grama de escarro, lavagem brônquica ou broncoalveolar, embora possa haver uma variedade de microrganismos, sempre orientará o diagnóstico, além de ser útil o tipo de célula observada.

No caso de escarro, a propagação deve ser preparada com as porções mais purulentas da amostra.

Grama de fezes

Gram não é recomendado para este tipo de amostra, pois não possui valor diagnóstico.

-Gram de culturas

Eles podem ser feitos de duas maneiras, uma de culturas líquidas e outra de culturas sólidas.

Culturas líquidas

De culturas líquidas é extremamente simples; Sob o queimador, vários assados ​​do caldo nublado são tomados e colocados em uma lâmina limpa e seca, dando movimentos circulares do centro para a periferia, para distribuir o material uniformemente.

É permitido secar espontaneamente no ar. Depois de seco, o material é fixado à chapa com calor. Para isso, com a ajuda de um grampo, a folha é passada de 3 a 4 vezes pela chama do queimador de Bunsen, tomando cuidado para não queimar o material.

A folha é deixada esfriar e colocada na ponte de coloração.

Culturas sólidas

Para executar uma extensão para coloração de Gram de uma cultura sólida, proceda da seguinte maneira:

Antes de escolher as colônias a serem colhidas, a lâmina deve ser preparada, colocando aproximadamente duas gotas de soro fisiológico estéril.

Se a placa de cultura original contiver vários tipos diferentes de colônias, uma colônia isolada de cada será escolhida para produzir o Gram. Cada colônia será coletada com a alça de platina para dissolvê-la na solução salina previamente colocada na lâmina.

Movimentos circulares são dados do centro para a periferia, para distribuir homogeneamente a colônia no slide.

É permitido secar espontaneamente no ar. Depois de seca, a chapa é fixada com calor, como explicado acima (inflamando a lâmina com o isqueiro), tomando cuidado para não queimar o material.

Este procedimento deve ser realizado com cada tipo de colônia diferente. A ordem do observado deve ser anotada em um artigo, por exemplo:

Colônia 1: Colônia amarela beta-hemolítica: Cocos Gram-positivos foram observados em aglomerados

Colônia 2: Colônia de cor creme, sem hemólise: foram observados cocobacilos Gram-negativos.

Cada folha deve ser rotulada para saber o que estamos observando.

Técnica

A técnica de coloração de Gram é extremamente simples de executar e relativamente barata e não pode faltar em um laboratório de microbiologia.

Isso é feito da seguinte maneira:

  1. Corrija o esfregaço com calor e coloque-o na ponte para colorir.
  2. A folha é completamente coberta com cristal violeta por 1 minuto.
  3. Lave com água. Não seco
  4. Cubra a folha com solução de lugol e deixe por 1 minuto. Lave com água. Não secar
  5. Alveje por 5-10 segundos com agitação suave em álcool acetona. Ou coloque a folha na posição vertical e solte gotas da lixívia na superfície até arrastar o vidro violeta não retido restante. Não exceder.
  6. Lave com água. Não secar
  7. Substitua a folha na ponte de coloração e cubra por 30 segundos com safranina (Gram-Hucker) ou 1 min com fucsina básica (Gram-Kopeloff).
  8. Lave com água
  9. Deixe o ar secar espontaneamente na posição vertical.
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Depois de seco, coloque 1 gota de óleo de imersão para observá-lo com o objetivo de 100X no microscópio óptico.

Utilitário

Essa técnica permite distinguir diferenças morfotécnicas da maioria das bactérias.

Leveduras também se distinguem com esta coloração. Eles pegam o cristal violeta, ou seja, mancham Gram-positivos.

Por outro lado, é possível distinguir os bacilos Gram-positivos formadores de esporos, nos quais é observado um espaço livre dentro do bacilo, onde a endosporo se formou, embora os esporos não mancham bem. Para tingir esporos, são utilizadas outras técnicas como Shaeffer-Fulton.

Deve-se notar que essa coloração não serve para colorir todos os tipos de bactérias, ou seja, há casos em que a coloração não funciona.

Nesse caso, bactérias que não possuem parede celular podem ser mencionadas. Por exemplo: gênero Mycoplasma, esferoplastos, Ureaplasma, formas L e protoplastos.

Também mancha muito as bactérias com paredes ricas em ácidos micólicos, como micobactérias e bactérias intracelulares, como clamídias e riquetsias.

Também é ineficaz na coloração da maioria das bactérias espirochetianas.

Existem bactérias do mesmo gênero que podem ser vistas na mesma amostra que Gram-positivas e Gram-negativas. Quando isso acontece, é denominada coloração variável de Gram, que pode ser causada por alteração dos nutrientes, temperatura, pH ou concentração de eletrólitos.

Erros comuns

Alvejante excessivo

Exagerar no passo de branqueamento pode causar a observação de microorganismos Gram-negativos falsos.

Não espere o tempo suficiente para secar para adicionar o óleo de imersão :

Esse erro causa a formação de micelas gordurosas que dificultam a observação das estruturas presentes. Isso ocorre quando o óleo se liga às moléculas de água presentes no esfregaço.

Inverta a ordem dos reagentes :

Um erro como esse fará com que bactérias Gram-negativas apareçam roxas, ou seja, Gram-positivas falsas.

Use culturas antigas (sólidas ou líquidas):

Pode fazer com que bactérias Gram-positivas mancham Gram-negativos (falsos Gram-negativos). Isso acontece porque em culturas antigas é provável que haja bactérias mortas ou danificadas e, nessas condições, as bactérias não retêm o cristal violeta.

Use uma solução de lugol muito antiga:

Com o tempo, Lugol perde suas propriedades e sua cor desaparece. Se o reagente já degenerado for utilizado, ele não fixará bem o cristal violeta; portanto, é possível obter uma visualização de microorganismos Gram-negativos falsamente.

Fundo azul

Um fundo adequadamente descolorido ficará vermelho. Um fundo azul indica que a descoloração foi insuficiente.

Referências

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