Proteinase K: características, atividade enzimática, aplicações

A proteinase K é uma enzima pertencente ao do grupo de proteases de serina, ou seja, que tem no seu meio um aminoácido serina cataliticamente activo e tem a função de quebrar as ligações de péptidos por hidrólise. Por sua vez, esta enzima pertence à família das proteínas subtilisina (S8 peptidase).

A proteinase K tem um peso molecular (MW) de 28.900 daltons e foi isolada pela primeira vez em 1974 em extratos do fungo Engyodontium album , anteriormente conhecido como Tritirachium album Limber.

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Estrutura molecular da proteinase K. Fonte: Lykchiniadis [CC BY-SA 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0)]

Possui alta capacidade proteolítica, demonstrada por ser capaz de degradar a queratina presente no cabelo. A palavra queratina em inglês é escrita “queratina”, por isso foi chamada de “proteinase K”.

Devido ao seu alto poder de clivar proteínas nativas, essa enzima é útil em várias técnicas de biologia molecular. É usado principalmente para isolar e preparar ácidos nucleicos com alto peso molecular (PM).

A proteinase K atua liberando DNA nuclear, destruindo proteínas e inativando RNases e DNases, ou seja, elimina nucleases nas preparações de DNA e RNA .

Por outro lado, foi observado que a proteinase K pode hidrolisar algumas proteínas nativas desnaturadas, o que despertou o interesse de pesquisadores pelo uso no estudo de proteínas de príons (PrP C ).

No entanto, apesar de sua alta potência proteolítica , existem proteínas resistentes à ação da proteinase K. Entre elas, existem algumas proteínas anômalas chamadas príons (PrP Sc ), associadas a encefalopatias espongiformes transmissíveis.

Características da proteinase K

A proteinase K tem uma estrutura terciária que consiste em três camadas, com uma folha β de sete filamentos entre duas camadas de hélices. Por pertencer à família das peptidases S8, caracteriza-se por apresentar em seu sítio ativo uma tríade catalítica, cuja ordem seqüencial é (Asp, His e Ser), que as diferencia de outras famílias de peptidases.

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Esta enzima do grupo serina protease é caracterizada por hidrólise das ligações peptídicas próximas ao grupo carboxílico dos aminoácidos alifáticos e aromáticos.

Por outro lado, é capaz de atuar na presença de determinadas substâncias corrosivas, como dodecilsulfato de sódio (SDS), Tris-HCL e EDTA, que são utilizadas para auxiliar na desnaturação de proteínas, causando perda de estrutura nativa.

Este é um passo anterior na preparação de proteínas para a técnica de eletroforese. A faixa de pH na qual a proteinase K atua é bastante ampla (2,0 a 12,0), com um pH ideal entre 7,5 e 12,0, e seu ponto isoelétrico é 8,9. Como pode ser visto, ele é ativo contra uma faixa muito ampla de pH.

Outra característica que se destaca na proteinase K é a sua estabilidade na presença de altas temperaturas (50-60 ° C).

Atividade enzimática

A proteinase K precisa da presença de íons cálcio, embora isso não afete sua atividade, se for essencial para manter sua estabilidade.

Para a proteinase K digerir completamente o substrato, é necessário um tempo de contato aproximado entre 5 minutos a 2 horas.

No entanto, nesse sentido, Daza e colaboradores compararam a pureza do DNA obtido em vários tempos de exposição à proteinase K e concluíram que uma incubação prolongada (até 24 h) melhora significativamente a qualidade do DNA.

Agora, em relação à concentração da enzima proteinase K nos diferentes protocolos, pode-se dizer que é muito variado.

Pode ser utilizado desde concentrações muito baixas (5 µg / ml) até concentrações de 500 µg / ml. Mas as concentrações de trabalho mais frequentes variam de 50 a 100μg / ml, especialmente para digestão de proteínas e inativação de nucleases. Embora para o tratamento de tecidos seja necessária uma concentração de 2 mg / ml.

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Aplicações

Suas aplicações são muito amplas e podem ser resumidas a seguir:

-É utilizado na digestão de proteínas e extração de DNA por vários métodos, tais como: salga-out, PK-SDS, brometo de cetil-trimetil amônio (CTAB), extração de acetato de potássio modificado e iodeto de sódio.

-Inativação de nucleases (RNases e DNases).

-Na técnica de hibridação in situ (HIS), para ajudar a liberar ácido nucleico, além de eliminar proteínas indesejáveis.

-Modificação de proteínas.

-No nível da pesquisa, em vários estudos.

Vantagens da proteinase K

Vários estudos comparativos foram realizados entre técnicas de extração de DNA que utilizam a Proteinase K, com outras que não a utilizam e todos concluem que há maiores benefícios ao usar a enzima. Entre as vantagens, podemos citar o seguinte:

-O DNA de alto peso molecular, alta qualidade e pureza é obtido.

-O DNA extraído é estável por até 3 meses.

O DNA extraído pode ser utilizado nas seguintes técnicas: Southern blot, reação em cadeia da polimerase (PCR), eletroforese, entre outras.

Proteínas resistentes à proteinase K

Várias investigações concluíram que os príons (proteínas anormais da PrPSc tóxicas) diferem das proteínas da PrPC (nativas) porque são resistentes à ação da proteinase K, enquanto as PrPCs são sensíveis à sua ação.

Outros autores descreveram que na estrutura do PrPSc existem porções sensíveis e outras resistentes à proteinase K. No entanto, ambas as partes são igualmente tóxicas e infecciosas.

Por outro lado, Bastian e colaboradores em 1987 isolaram 4 proteínas de 28, 30, 66 e 76 kda de uma espécie de Spiroplasma mirum . Todos foram considerados resistentes à ação da proteinase K e também tiveram uma reação cruzada com alguns príons.

Sabe-se que esta espécie pode causar catarata e danos neurológicos significativos e, devido às descobertas científicas de Bastian, entre outras investigações, tentou-se relacionar esse microrganismo com encefalopatias espongiformes transmissíveis.

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No entanto, a etiologia dessa patologia neurológica degenerativa ainda é atribuída aos príons hoje.

Nesse sentido, Butler e colaboradores, em 1991, identificaram e caracterizaram uma classe de proteína resistente à proteína K de 40 kda de duas linhagens de Mycoplasma hyorhinis. Esse patógeno afeta os porcos, infectando seus tecidos, mas neste caso não houve reação cruzada com os príons testados.

É necessária mais pesquisa para elucidar muitas incógnitas sobre o assunto.

Referências

  1. Bastian F, Jennings R e Gardner W. 1987. O anti-soro da proteína fibril associada ao scrapie reage de maneira cruzada com as proteínas fibrilares Spiroplasma miru m . J. Clin. Microbiol 25: 2430-2431.
  2. Daza C, Guillen J, King J, Ruiz V. Avaliação de um método de extração e purificação de DNA a partir de tecido muscular fixado em formaldeído de corpos não identificados.Med Magazine , 2014; 22 (1): 42-49,
  3. Butler G, Kotani H, Kong L, Frick M, Evancho S, Stanbridge E e Mcgarrity G. Identificação e caracterização de proteínas resistentes à proteinase K em membros da classe Mollicutes. Infecção e Imunidade, 1991, 59 (3): 1037-1042
  4. López M, Rivera M, Viettri M, Lares M, Morocoima A, Herrera L, et al. Comparação de dois protocolos de extração de DNA de Trypanosoma cruzi cultivados em meio axênico. Rev. Peru. Med. Exp. Saúde Pública 2014; 31 (2): 222-227. Disponível em: scielo.org
  5. Jiménez G, Villalobos M, Jiménez E e Palma W. Determinação da eficácia de cinco protocolos de extração de DNA de material parafinado para estudos moleculares. Rev Méd Univ Costa Rica. 2007; 1 (1): 10-19.

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