O sequenciamento de DNA é uma técnica fundamental na área da genética molecular, permitindo a determinação da sequência de nucleotídeos em um fragmento de DNA. O método de sequenciamento de Maxam-Gilbert é uma das abordagens pioneiras nesse campo, desenvolvido por Allan Maxam e Walter Gilbert na década de 1970. Este método utiliza a clivagem química do DNA em diferentes locais para determinar a sequência de nucleotídeos. Neste artigo, vamos explorar o funcionamento do método de Maxam-Gilbert e apresentar alguns exemplos de sua aplicação na pesquisa científica.
Conheça os principais métodos utilizados para sequenciar o genoma humano e outros organismos.
Atualmente, existem vários métodos usados para sequenciar o genoma humano e outros organismos. Um desses métodos é o método de Maxam-Gilbert, nomeado em homenagem aos seus criadores, Allan Maxam e Walter Gilbert.
O método de Maxam-Gilbert foi desenvolvido na década de 1970 e envolve a quebra química do DNA em fragmentos específicos. Estes fragmentos são então separados e sequenciados para determinar a ordem das bases nitrogenadas no DNA. Este método foi um dos primeiros a ser utilizado para sequenciar o genoma humano e foi fundamental para o Projeto Genoma Humano.
Uma das vantagens do método de Maxam-Gilbert é a sua capacidade de sequenciar regiões específicas do DNA com alta precisão. Isso o torna útil para identificar mutações genéticas e para estudar a estrutura de genes individuais. No entanto, o método de Maxam-Gilbert é trabalhoso e demorado, o que limita a sua aplicação em larga escala.
Apesar das limitações, o método de Maxam-Gilbert ainda é utilizado em laboratórios de pesquisa para sequenciar pequenas regiões do genoma. Com o avanço da tecnologia, novos métodos de sequenciamento de DNA, como o método de Sanger e a tecnologia de sequenciamento de próxima geração, tornaram-se mais populares devido à sua rapidez e eficiência.
Em resumo, o método de Maxam-Gilbert é um dos métodos pioneiros de sequenciamento de DNA e continua sendo utilizado em contextos específicos. No entanto, com o avanço da tecnologia, novos métodos mais eficientes e rápidos estão sendo desenvolvidos para sequenciar o genoma humano e outros organismos.
Principais técnicas para sequenciar o DNA mais utilizadas na atualidade.
Atualmente, existem várias técnicas utilizadas para sequenciar o DNA, sendo as mais comuns o método de Sanger (também conhecido como método de terminação de cadeia) e o sequenciamento de nova geração (NGS). O método de Sanger, desenvolvido por Frederick Sanger e Alan Coulson em 1977, foi uma das primeiras abordagens para sequenciar o DNA.
O método de Sanger utiliza ddNTPs marcados com diferentes cores para interromper a replicação do DNA em pontos específicos, permitindo a leitura das bases presentes na sequência. Esse método é considerado confiável e preciso, sendo amplamente utilizado em laboratórios de pesquisa e diagnóstico.
Já o sequenciamento de nova geração (NGS) é uma técnica mais recente que permite a análise de múltiplas amostras de DNA de forma simultânea e em alta velocidade. Essa abordagem é baseada em sequenciamento em paralelo, onde milhões de fragmentos de DNA são sequenciados ao mesmo tempo.
Além do método de Sanger e do sequenciamento de nova geração, outras técnicas como o sequenciamento por síntese (Illumina), sequenciamento por ion torrent (Ion Proton) e sequenciamento por nanoporos (MinION) também são amplamente utilizadas na atualidade. Cada uma dessas técnicas possui suas próprias vantagens e limitações, sendo escolhidas de acordo com o objetivo da pesquisa e o orçamento disponível.
Em resumo, as principais técnicas para sequenciar o DNA mais utilizadas na atualidade são o método de Sanger e o sequenciamento de nova geração, juntamente com outras abordagens como o sequenciamento por síntese, por ion torrent e por nanoporos. Essas técnicas têm revolucionado a genética e a biologia molecular, possibilitando avanços significativos no estudo do DNA e sua aplicação em diversas áreas da ciência.
Conhecendo o método de sequenciamento de Sanger para análise de DNA.
O método de sequenciamento de Sanger é uma técnica amplamente utilizada para analisar o DNA. Desenvolvido por Frederick Sanger na década de 1970, este método revolucionou a genética molecular e permitiu avanços significativos na compreensão da estrutura e função do DNA.
No método de Sanger, o DNA a ser sequenciado é fragmentado em pedaços menores e marcado com nucleotídeos modificados que bloqueiam a síntese de novas cadeias de DNA. Esses nucleotídeos modificados são chamados de ddNTPs, e cada um deles é marcado com uma cor diferente para que possam ser identificados durante a análise.
A partir daí, o DNA é submetido a uma reação de amplificação em cadeia, onde são produzidas várias cópias do fragmento de DNA. Cada cópia contém uma mistura de nucleotídeos normais e ddNTPs modificados, o que resulta na síntese de cadeias de DNA de diferentes comprimentos.
As cadeias de DNA resultantes são então separadas por eletroforese em gel, onde são separadas com base no tamanho. A medida que as cadeias de DNA passam pelo gel, um scanner detecta as cores dos ddNTPs modificados, permitindo a leitura da sequência de nucleotídeos.
O método de Sanger é amplamente utilizado em laboratórios de pesquisa e diagnóstico, devido à sua precisão e confiabilidade. Ele é essencial para a realização de estudos genéticos, diagnósticos de doenças genéticas e sequenciamento de genomas inteiros.
Em resumo, o método de sequenciamento de Sanger é uma ferramenta poderosa para a análise de DNA, permitindo aos cientistas decifrar a sequência de nucleotídeos e compreender a complexidade do material genético. Trata-se de uma técnica fundamental para o avanço da genética e biologia molecular.
Conheça as fases do sequenciamento do DNA em detalhes e passo a passo.
O sequenciamento do DNA é um processo complexo que envolve várias etapas para determinar a ordem exata das bases nitrogenadas em uma molécula de DNA. Existem diferentes métodos de sequenciamento de DNA, sendo um deles o método de Maxam-Gilbert, que foi desenvolvido na década de 1970.
As fases do sequenciamento do DNA pelo método de Maxam-Gilbert envolvem várias etapas. Primeiramente, a molécula de DNA é desnaturada, ou seja, as duas fitas de DNA são separadas. Em seguida, a molécula de DNA é dividida em quatro amostras, cada uma contendo uma base específica marcada radioativamente.
Depois disso, é realizado o tratamento químico das amostras, que provoca a clivagem das ligações fosfodiéster em locais específicos, dependendo da base presente em cada amostra. Isso resulta na geração de fragmentos de DNA de diferentes tamanhos, que são separados por eletroforese em gel.
Os fragmentos de DNA separados são então visualizados em uma placa de autoradiografia, onde é possível determinar a ordem das bases nitrogenadas com base no tamanho dos fragmentos e nas posições das bandas radioativas. Essas informações são utilizadas para reconstruir a sequência de nucleotídeos da molécula de DNA original.
O método de Maxam-Gilbert foi um dos primeiros métodos de sequenciamento de DNA desenvolvidos e contribuiu significativamente para avanços na genética e biologia molecular. Atualmente, existem métodos mais avançados e automatizados, como o sequenciamento de nova geração, que permitem a análise de grandes quantidades de DNA de forma mais rápida e eficiente.
Sequenciamento de DNA: Maxam-Gilbert, método e exemplos
O seqüenciamento do DNA (ácido desoxirribonucleico) é um procedimento realizado em laboratórios de biologia molecular que permite conhecer a ordem dos nucleotídeos no material genético de interesse. Além disso, o seqüenciamento do RNA (ácido ribonucleico) também pode ser revelado.
Esta técnica tem sido indispensável para o desenvolvimento das ciências biológicas. Também é aplicável a outros campos do conhecimento – como diagnóstico médico e investigações forenses, por exemplo.
Anteriormente, o seqüenciamento de uma fita de DNA era considerado uma atividade lenta e cara, o que permitia a identificação de apenas alguns pares de bases nos oligonucleotídeos.
Hoje, com todos os avanços da ciência, o seqüenciamento de DNA é uma operação rotineira em muitos laboratórios em todo o mundo, graças à contribuição de quase 50 anos de pesquisa nesse campo. Quanto ao comprimento da cadeia, até milhões de pares de bases podem ser sequenciados em um tempo muito curto.
Para fazer isso, existem dezenas de técnicas desenvolvidas que variam em preço e precisão. Neste artigo, descreveremos técnicas clássicas e modernas, cada uma com suas vantagens e desvantagens.
Até agora, as técnicas de sequenciamento permitem obter a sequência de genomas completos, desde pequenos procariotos e leveduras até o genoma humano.
Estrutura de DNA
Para entender os métodos e técnicas utilizados para o seqüenciamento de DNA, é necessário conhecer certos aspectos-chave da estrutura e composição da molécula.
O DNA é uma biomolécula encontrada em todos os seres vivos, de bactérias a grandes animais aquáticos. Organelas – como mitocôndrias e cloroplastos – têm uma molécula circular de DNA dentro. Mesmo em alguns vírus, o material genético encontrado é o DNA.
Estruturalmente, o DNA é um conjunto de nucleotídeos. Cada um é composto por um carboidrato, uma base de nitrogênio (A, T, C ou G) e um grupo fosfato. O objetivo do seqüenciamento de DNA é desvendar a ordem na qual as quatro bases nitrogenadas são encontradas na sequência.
História
Em meados da década de 1950, os pesquisadores Watson e Crick descreveram a estrutura do DNA usando técnicas cristológicas. No entanto, nenhum desses pesquisadores conseguiu encontrar uma maneira de desvendar a sequência.
Embora houvesse certos antecessores, o evento mais importante foi a criação do método Sanger, em 1977. Frederick Sanger, o pai do método, era um bioquímico britânico, vencedor de dois prêmios Nobel por suas enormes contribuições para as ciências biológicas.
Esta técnica também é conhecida na literatura como “terminação da cadeia” ou didesoxinucleotídeos. Os princípios desta técnica e os desenvolvidos com base no aprimoramento e inovação dessa técnica serão descritos abaixo.
Método Sanger
O desenvolvimento do método de Sanger representou um evento crucial na biologia molecular. Envolve os componentes básicos do processo de replicação do DNA que normalmente ocorre na célula, mas adicionando um componente especial: didesoxinucleotídeos.
Principais componentes da reação
– DNA polimerase: A enzima DNA polimerase é um elemento crucial do processo. Essa molécula participa da replicação da fita de DNA e seu papel é a síntese da nova cadeia, emparelhando os desoxirribonucleotídeos trifosfato com os complementares.
Lembre-se de que no DNA a timina (T) é acoplada às adeninas (A) por meio de duas ligações de hidrogênio, enquanto a citosina (C) o faz com a guanina (G) através de três pontes.
– Nucleotídeos: o seqüenciamento de Sanger envolve dois tipos de nucleotídeos, os quatro 2′-desoxinucleotídeos (abreviados como dATP, dGTP, dCTP e dTTP) e os quatro didesoxinucleotídeos especiais (ddATP, ddGTP, ddCTP e ddTTP).
Embora os didesoxinucleotídeos sejam semelhantes aos monômeros que normalmente são incorporados ao DNA, eles não possuem um grupo -OH em sua estrutura. Isso torna impossível adicionar um novo nucleotídeo à cadeia.
Portanto, quando um nucleotídeo especial é adicionado – completamente aleatoriamente – à cadeia em formação, a síntese é paralisada. Assim, no final da reação, existem cadeias de tamanhos diferentes, cada uma em que a reação foi interrompida em um ponto diferente.
Experimentalmente, quatro ensaios são preparados. Cada um contém o DNA extraído da amostra biológica de interesse, nucleotídeos normais e um dos quatro tipos de nucleotídeos especiais. Ou, nucleotídeos especiais são marcados com algum tipo de marcador fluorescente (veja o sequenciamento automático abaixo).
Lendo os resultados
O primeiro passo é separar cada uma das seqüências sintetizadas de acordo com seu tamanho. Alguns serão mais longos que outros, dependendo de onde as bases especiais foram incorporadas.
Existem diferentes técnicas bioquímicas que permitem a separação dos componentes de uma mistura usando o tamanho como uma propriedade discriminatória. No método de Sanger, as diferentes cadeias são separadas por eletroforese. Nas variantes mais sofisticadas da técnica, a eletroforese capilar é utilizada.
Assim, fios mais longos movem menos que variantes mais curtas. Este sistema passa por um leitor que reconhece o marcador incluído em cada didesoxinucleotídeo. Dessa maneira, a ordem da sequência pode ser conhecida.
Essa técnica de “primeira geração” é capaz de ler fragmentos de DNA não maiores que 1 kilobase. Atualmente, o método Sanger é usado em vários laboratórios, geralmente em suas variantes modernas. Além disso, é usado para corroborar os resultados obtidos com as técnicas mais complexas – mas menos precisas.
Sequenciamento automático
Quando o seqüenciamento em larga escala é necessário, o processo é acelerado por meio da automação. Essa é uma variação do método de terminação da cadeia Sanger, onde os primers são rotulados com produtos fluorescentes para distingui-los.
Posteriormente, o produto da reação é executado em uma eletroforese – tudo em uma única faixa. Quando cada fragmento sai da porção final do gel, é rapidamente identificado pelo seu rótulo fluorescente, com um erro em torno de 1%.
Os sistemas mais sofisticados possuem um sistema de até 96 tubos capilares operados por um computador acoplado a um robô. Ou seja, 96 amostras de DNA podem ser avaliadas simultaneamente. Assim, o processo de eletroforese e a análise dos resultados são totalmente automatizados.
Em um dia, esses sistemas podem sequenciar até 550.000 bases. Durante o processo, o trabalho humano é desnecessário, leva apenas 15 minutos para iniciar o método.
Sequenciação de Maxam-Gilbert
Ao mesmo tempo em que Sanger publicou seu trabalho, dois pesquisadores chamados Allan Maxan e Walter Gilbert conseguiram desenvolver outro método para obter a sequência de DNA. O método ganhou popularidade na época, mas mais tarde foi deslocado pelo aprimoramento do método Sanger.
Ao contrário do método de Sanger, o seqüenciamento de Maxan e Gilbert (ou sequenciamento químico, como também é conhecido) não envolve reações de hibridação. A metodologia consiste em marcar com agentes reativos em uma extremidade, seguido de um processo de purificação.
Um dos aspectos negativos dessa técnica é sua enorme complexidade e o uso de produtos químicos perigosos para o usuário. As rupturas químicas são induzidas pela aplicação de DMS, ácido fórmico, hidrazina e hidrazina com sais.
Procedimento
O protocolo começa com a marcação na extremidade 5 ‘da fita com o marcador de fósforo 32, então ocorre uma modificação química da base de nitrogênio e ela se separa. Finalmente, ocorre a excisão da região abásica.
Primeiro, a cadeia que você deseja sequenciar em segmentos menores é reduzida. Esta etapa é realizada com enzimas de restrição, que resultam em extremos pendentes.
Em seguida, a reação é realizada com uma fosfatase alcalina, cujo objetivo é remover o grupo fosfato. Assim, uma polinucleotídeo cinase pode ser usada para realizar a marcação.
A corrente é desnaturada (os dois fios abertos). Em seguida, prossiga para aplicar os produtos químicos. Essas reações de clivagem são realizadas de maneira controlada e sabe-se que tipos de ligações quebram cada produto químico aplicado.
Lendo os resultados
Como no método de Sanger, a leitura dos resultados envolve a separação por tamanho das cadeias obtidas em um sistema de eletroforese. Os sistemas compostos de poliacrilamida permitem obter uma resolução muito adequada para a leitura do gel.
Sequenciamento em massa
O sequenciamento em massa abrange uma série de novos métodos, abreviados como NGS, do inglês “ Next Generation Sequencing”.
Os métodos catalogados como NGS requerem uma etapa anterior de amplificação de DNA (eles não funcionam com uma única molécula). Além disso, as plataformas utilizadas variam amplamente. Os princípios dos métodos mais populares serão descritos abaixo:
Pirosequencing
Envolve monitorar a liberação de um pirofosfato, que ocorre toda vez que um novo nucleotídeo é adicionado à cadeia de DNA. Um sistema enzimático é acoplado, de modo que a emissão de luz (que é detectável por uma câmera) ocorre cada vez que um novo nucleotídeo é incorporado.
O processo começa com a incubação separada de cada base de nitrogênio para verificar se há ou não emissão de luz. A piroseqüenciação pode ler fios longos, mas a taxa de erro encontrada é alta.
Sequenciação por síntese
Isso envolve a incorporação de nucleotídeos marcados. Estes componentes fluorescentes são adicionados, lavados e o nucleotídeo incorporado é observado. Em seguida, a marcação de nucleotídeos é eliminada e a síntese da fita pode continuar. Na próxima etapa, um nucleotídeo marcado também será incorporado e as etapas mencionadas serão repetidas.
Uma desvantagem dessa técnica ocorre quando os marcadores fluorescentes não são completamente eliminados. Essas emissões criam erros de segundo plano, resultando em erros significativos.
Sequenciação por ligação
Essa técnica varia das demais, pois não utiliza DNA polimerase. Em vez disso, a principal enzima para essa metodologia é a ligase. Aqui fragmentos de DNA marcados com fluorescência são usados, ligados pela enzima e detectados.
O maior problema com essa técnica é o tamanho curto do fragmento que é capaz de processar.
Ion Sequenciamento de torrents
Essa técnica é baseada na medição do íon H + que é liberado toda vez que um novo nucleotídeo é incorporado. O princípio é bastante semelhante ao da pirosequenciamento, mas muito mais barato.
Exemplos
O seqüenciamento do genoma humano
Sequenciar o genoma dos seres humanos tem sido um dos desafios mais promissores da biologia, além de ser uma das rivalidades mais aclamadas da história da ciência. De fato, para os cientistas envolvidos no projeto, o sequenciamento do genoma se tornou uma competição.
Em 1990, ele começou o chamado “projeto genoma humano”, liderado pelo famoso cientista vencedor do Prêmio Nobel, James Watson. Depois de um ano, em 1991, Venter assume o desafio de “derrotar” Watson e sequenciar o genoma antes dele. No entanto, em 1992, Watson se aposentou e outro investigador assumiu.
Em 1995, Venter anunciou seu sucesso no sequenciamento completo de um genoma bacteriano pelo método de sequenciamento aleatório. Da mesma forma, a equipe adversária anunciou um ano depois o sequenciamento do genoma da levedura.
Em 2000, a corrida foi encerrada. Ambas as empresas publicaram seus resultados preliminares do genoma completo em duas das mais prestigiadas revistas científicas: Natureza e Ciência.
No entanto, os cientistas continuaram trabalhando para melhorar as propostas e, em 2006, as seqüências de certos cromossomos humanos foram encerradas.
Importância e aplicações
Conhecer a ordem dos nucleotídeos de uma molécula tão importante quanto o DNA é valioso para biólogos e profissionais relacionados. Esta cadeia polinucleotídica contém todas as informações necessárias para o desenvolvimento e manutenção de todas as formas de vida.
Por essas razões, o conhecimento dessa sequência é essencial para a pesquisa biológica. Fundamentalmente, o seqüenciamento permite medir uma das propriedades mais importantes dos sistemas biológicos e estabelecer diferenças entre eles.
O seqüenciamento é amplamente utilizado por taxonomistas e sistemáticos, uma vez que determinadas seqüências de DNA permitem estabelecer critérios para concluir se dois organismos pertencem à mesma espécie ou não, além de poder propor hipóteses sobre as relações filogenéticas entre eles.
Além disso, o seqüenciamento de DNA tem aplicações no campo da medicina e diagnóstico. Por exemplo, existem sistemas econômicos e acessíveis que, por sequenciamento, permitem avaliar a tendência de desenvolver certas doenças (como o câncer), usando os chamados polimorfismos nucleotídicos simples (SNPs).
As investigações criminais e forenses também foram enriquecidas com técnicas de sequenciamento e podem ser usadas como evidência confiável da participação de um determinado indivíduo em um crime.
Referências
- Heather, JM, & Chain, B. (2016). A sequência dos seqüenciadores: a história do seqüenciamento do DNA.Genomics , 107 (1), 1-8.
- Koboldt, DC, Steinberg, KM, Larson, DE, Wilson, RK e Mardis, ER (2013). A revolução de sequenciamento de última geração e seu impacto na genômica.Cell , 155 (1), 27-38.
- Levy, J. (2010).Rivalidades científicas Do Galileo ao projeto do genoma humano . Editorial Paraninfo.
- Sanger, F., Nicklen, S., & Coulson, AR (1977). Sequenciação de DNA com inibidores de terminação de cadeia.Anais da Academia Nacional de Ciências , 74 (12), 5463-5467.
- Schuster, SC (2007). O sequenciamento de próxima geração transforma a biologia atual.Métodos da natureza , 5 (1), 16.
- Xu, J. (Ed.). (2014).Sequenciamento de próxima geração . Caister Academic Press.