Sequenciamento de DNA: Maxam-Gilbert, método e exemplos

O seqüenciamento do DNA (ácido desoxirribonucleico) é um procedimento realizado em laboratórios de biologia molecular que permite conhecer a ordem dos nucleotídeos no material genético de interesse. Além disso, o seqüenciamento do RNA (ácido ribonucleico) também pode ser revelado.

Esta técnica tem sido indispensável para o desenvolvimento das ciências biológicas. Também é aplicável a outros campos do conhecimento – como diagnóstico médico e investigações forenses, por exemplo.

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Fonte: pixabay.com

Anteriormente, o seqüenciamento de uma fita de DNA era considerado uma atividade lenta e cara, o que permitia a identificação de apenas alguns pares de bases nos oligonucleotídeos.

Hoje, com todos os avanços da ciência, o seqüenciamento de DNA é uma operação rotineira em muitos laboratórios em todo o mundo, graças à contribuição de quase 50 anos de pesquisa nesse campo. Quanto ao comprimento da cadeia, até milhões de pares de bases podem ser sequenciados em um tempo muito curto.

Para fazer isso, existem dezenas de técnicas desenvolvidas que variam em preço e precisão. Neste artigo, descreveremos técnicas clássicas e modernas, cada uma com suas vantagens e desvantagens.

Até agora, as técnicas de sequenciamento permitem obter a sequência de genomas completos, desde pequenos procariotos e leveduras até o genoma humano.

Estrutura de DNA

Para entender os métodos e técnicas utilizados para o seqüenciamento de DNA, é necessário conhecer certos aspectos-chave da estrutura e composição da molécula.

O DNA é uma biomolécula encontrada em todos os seres vivos, de bactérias a grandes animais aquáticos. Organelas – como mitocôndrias e cloroplastos – têm uma molécula circular de DNA dentro. Mesmo em alguns vírus, o material genético encontrado é o DNA.

Estruturalmente, o DNA é um conjunto de nucleotídeos. Cada um é composto por um carboidrato, uma base de nitrogênio (A, T, C ou G) e um grupo fosfato. O objetivo do seqüenciamento de DNA é desvendar a ordem na qual as quatro bases nitrogenadas são encontradas na sequência.

História

Em meados da década de 1950, os pesquisadores Watson e Crick descreveram a estrutura do DNA usando técnicas cristológicas. No entanto, nenhum desses pesquisadores conseguiu encontrar uma maneira de desvendar a sequência.

Embora houvesse certos antecessores, o evento mais importante foi a criação do método Sanger, em 1977. Frederick Sanger, o pai do método, era um bioquímico britânico, vencedor de dois prêmios Nobel por suas enormes contribuições para as ciências biológicas.

Esta técnica também é conhecida na literatura como “terminação da cadeia” ou didesoxinucleotídeos. Os princípios desta técnica e os desenvolvidos com base no aprimoramento e inovação dessa técnica serão descritos abaixo.

Método Sanger

O desenvolvimento do método de Sanger representou um evento crucial na biologia molecular. Envolve os componentes básicos do processo de replicação do DNA que normalmente ocorre na célula, mas adicionando um componente especial: didesoxinucleotídeos.

Principais componentes da reação

– DNA polimerase: A enzima DNA polimerase é um elemento crucial do processo. Essa molécula participa da replicação da fita de DNA e seu papel é a síntese da nova cadeia, emparelhando os desoxirribonucleotídeos trifosfato com os complementares.

Lembre-se de que no DNA a timina (T) é acoplada às adeninas (A) por meio de duas ligações de hidrogênio, enquanto a citosina (C) o faz com a guanina (G) através de três pontes.

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– Nucleotídeos: o seqüenciamento de Sanger envolve dois tipos de nucleotídeos, os quatro 2′-desoxinucleotídeos (abreviados como dATP, dGTP, dCTP e dTTP) e os quatro didesoxinucleotídeos especiais (ddATP, ddGTP, ddCTP e ddTTP).

Embora os didesoxinucleotídeos sejam semelhantes aos monômeros que normalmente são incorporados ao DNA, eles não possuem um grupo -OH em sua estrutura. Isso torna impossível adicionar um novo nucleotídeo à cadeia.

Portanto, quando um nucleotídeo especial é adicionado – completamente aleatoriamente – à cadeia em formação, a síntese é paralisada. Assim, no final da reação, existem cadeias de tamanhos diferentes, cada uma em que a reação foi interrompida em um ponto diferente.

Experimentalmente, quatro ensaios são preparados. Cada um contém o DNA extraído da amostra biológica de interesse, nucleotídeos normais e um dos quatro tipos de nucleotídeos especiais. Ou, nucleotídeos especiais são marcados com algum tipo de marcador fluorescente (veja o sequenciamento automático abaixo).

Lendo os resultados

O primeiro passo é separar cada uma das seqüências sintetizadas de acordo com seu tamanho. Alguns serão mais longos que outros, dependendo de onde as bases especiais foram incorporadas.

Existem diferentes técnicas bioquímicas que permitem a separação dos componentes de uma mistura usando o tamanho como uma propriedade discriminatória. No método de Sanger, as diferentes cadeias são separadas por eletroforese. Nas variantes mais sofisticadas da técnica, a eletroforese capilar é utilizada.

Assim, fios mais longos movem menos que variantes mais curtas. Este sistema passa por um leitor que reconhece o marcador incluído em cada didesoxinucleotídeo. Dessa maneira, a ordem da sequência pode ser conhecida.

Essa técnica de “primeira geração” é capaz de ler fragmentos de DNA não maiores que 1 kilobase. Atualmente, o método Sanger é usado em vários laboratórios, geralmente em suas variantes modernas. Além disso, é usado para corroborar os resultados obtidos com as técnicas mais complexas – mas menos precisas.

Sequenciamento automático

Quando o seqüenciamento em larga escala é necessário, o processo é acelerado por meio da automação. Essa é uma variação do método de terminação da cadeia Sanger, onde os primers são rotulados com produtos fluorescentes para distingui-los.

Posteriormente, o produto da reação é executado em uma eletroforese – tudo em uma única faixa. Quando cada fragmento sai da porção final do gel, é rapidamente identificado pelo seu rótulo fluorescente, com um erro em torno de 1%.

Os sistemas mais sofisticados possuem um sistema de até 96 tubos capilares operados por um computador acoplado a um robô. Ou seja, 96 amostras de DNA podem ser avaliadas simultaneamente. Assim, o processo de eletroforese e a análise dos resultados são totalmente automatizados.

Em um dia, esses sistemas podem sequenciar até 550.000 bases. Durante o processo, o trabalho humano é desnecessário, leva apenas 15 minutos para iniciar o método.

Sequenciação de Maxam-Gilbert

Ao mesmo tempo em que Sanger publicou seu trabalho, dois pesquisadores chamados Allan Maxan e Walter Gilbert conseguiram desenvolver outro método para obter a sequência de DNA. O método ganhou popularidade na época, mas mais tarde foi deslocado pelo aprimoramento do método Sanger.

Ao contrário do método de Sanger, o seqüenciamento de Maxan e Gilbert (ou sequenciamento químico, como também é conhecido) não envolve reações de hibridação. A metodologia consiste em marcar com agentes reativos em uma extremidade, seguido de um processo de purificação.

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Um dos aspectos negativos dessa técnica é sua enorme complexidade e o uso de produtos químicos perigosos para o usuário. As rupturas químicas são induzidas pela aplicação de DMS, ácido fórmico, hidrazina e hidrazina com sais.

Procedimento

O protocolo começa com a marcação na extremidade 5 ‘da fita com o marcador de fósforo 32, então ocorre uma modificação química da base de nitrogênio e ela se separa. Finalmente, ocorre a excisão da região abásica.

Primeiro, a cadeia que você deseja sequenciar em segmentos menores é reduzida. Esta etapa é realizada com enzimas de restrição, que resultam em extremos pendentes.

Em seguida, a reação é realizada com uma fosfatase alcalina, cujo objetivo é remover o grupo fosfato. Assim, uma polinucleotídeo cinase pode ser usada para realizar a marcação.

A corrente é desnaturada (os dois fios abertos). Em seguida, prossiga para aplicar os produtos químicos. Essas reações de clivagem são realizadas de maneira controlada e sabe-se que tipos de ligações quebram cada produto químico aplicado.

Lendo os resultados

Como no método de Sanger, a leitura dos resultados envolve a separação por tamanho das cadeias obtidas em um sistema de eletroforese. Os sistemas compostos de poliacrilamida permitem obter uma resolução muito adequada para a leitura do gel.

Sequenciamento em massa

O sequenciamento em massa abrange uma série de novos métodos, abreviados como NGS, do inglês “ Next Generation Sequencing”.

Os métodos catalogados como NGS requerem uma etapa anterior de amplificação de DNA (eles não funcionam com uma única molécula). Além disso, as plataformas utilizadas variam amplamente. Os princípios dos métodos mais populares serão descritos abaixo:

Pirosequencing

Envolve monitorar a liberação de um pirofosfato, que ocorre toda vez que um novo nucleotídeo é adicionado à cadeia de DNA. Um sistema enzimático é acoplado, de modo que a emissão de luz (que é detectável por uma câmera) ocorre cada vez que um novo nucleotídeo é incorporado.

O processo começa com a incubação separada de cada base de nitrogênio para verificar se há ou não emissão de luz. A piroseqüenciação pode ler fios longos, mas a taxa de erro encontrada é alta.

Sequenciação por síntese

Isso envolve a incorporação de nucleotídeos marcados. Estes componentes fluorescentes são adicionados, lavados e o nucleotídeo incorporado é observado. Em seguida, a marcação de nucleotídeos é eliminada e a síntese da fita pode continuar. Na próxima etapa, um nucleotídeo marcado também será incorporado e as etapas mencionadas serão repetidas.

Uma desvantagem dessa técnica ocorre quando os marcadores fluorescentes não são completamente eliminados. Essas emissões criam erros de segundo plano, resultando em erros significativos.

Sequenciação por ligação

Essa técnica varia das demais, pois não utiliza DNA polimerase. Em vez disso, a principal enzima para essa metodologia é a ligase. Aqui fragmentos de DNA marcados com fluorescência são usados, ligados pela enzima e detectados.

O maior problema com essa técnica é o tamanho curto do fragmento que é capaz de processar.

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Ion Sequenciamento de torrents

Essa técnica é baseada na medição do íon H + que é liberado toda vez que um novo nucleotídeo é incorporado. O princípio é bastante semelhante ao da pirosequenciamento, mas muito mais barato.

Exemplos

O seqüenciamento do genoma humano

Sequenciar o genoma dos seres humanos tem sido um dos desafios mais promissores da biologia, além de ser uma das rivalidades mais aclamadas da história da ciência. De fato, para os cientistas envolvidos no projeto, o sequenciamento do genoma se tornou uma competição.

Em 1990, ele começou o chamado “projeto genoma humano”, liderado pelo famoso cientista vencedor do Prêmio Nobel, James Watson. Depois de um ano, em 1991, Venter assume o desafio de “derrotar” Watson e sequenciar o genoma antes dele. No entanto, em 1992, Watson se aposentou e outro investigador assumiu.

Em 1995, Venter anunciou seu sucesso no sequenciamento completo de um genoma bacteriano pelo método de sequenciamento aleatório. Da mesma forma, a equipe adversária anunciou um ano depois o sequenciamento do genoma da levedura.

Em 2000, a corrida foi encerrada. Ambas as empresas publicaram seus resultados preliminares do genoma completo em duas das mais prestigiadas revistas científicas: Natureza e Ciência.

No entanto, os cientistas continuaram trabalhando para melhorar as propostas e, em 2006, as seqüências de certos cromossomos humanos foram encerradas.

Importância e aplicações

Conhecer a ordem dos nucleotídeos de uma molécula tão importante quanto o DNA é valioso para biólogos e profissionais relacionados. Esta cadeia polinucleotídica contém todas as informações necessárias para o desenvolvimento e manutenção de todas as formas de vida.

Por essas razões, o conhecimento dessa sequência é essencial para a pesquisa biológica. Fundamentalmente, o seqüenciamento permite medir uma das propriedades mais importantes dos sistemas biológicos e estabelecer diferenças entre eles.

O seqüenciamento é amplamente utilizado por taxonomistas e sistemáticos, uma vez que determinadas seqüências de DNA permitem estabelecer critérios para concluir se dois organismos pertencem à mesma espécie ou não, além de poder propor hipóteses sobre as relações filogenéticas entre eles.

Além disso, o seqüenciamento de DNA tem aplicações no campo da medicina e diagnóstico. Por exemplo, existem sistemas econômicos e acessíveis que, por sequenciamento, permitem avaliar a tendência de desenvolver certas doenças (como o câncer), usando os chamados polimorfismos nucleotídicos simples (SNPs).

As investigações criminais e forenses também foram enriquecidas com técnicas de sequenciamento e podem ser usadas como evidência confiável da participação de um determinado indivíduo em um crime.

Referências

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  3. Levy, J. (2010).Rivalidades científicas Do Galileo ao projeto do genoma humano . Editorial Paraninfo.
  4. Sanger, F., Nicklen, S., & Coulson, AR (1977). Sequenciação de DNA com inibidores de terminação de cadeia.Anais da Academia Nacional de Ciências , 74 (12), 5463-5467.
  5. Schuster, SC (2007). O sequenciamento de próxima geração transforma a biologia atual.Métodos da natureza , 5 (1), 16.
  6. Xu, J. (Ed.). (2014).Sequenciamento de próxima geração . Caister Academic Press.

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