Teste da oxidase: justificativa, procedimento e usos

O teste da oxidase é um método de diagnóstico que demonstra a presença do complexo enzimático denominado citocromo oxidase c. Este sistema induz a transformação do citocromo reduzido em oxidado, pois captura o oxigênio e, por sua vez, atua como o último aceitador de elétrons (H + ) na cadeia respiratória.

O termo oxidase é uma maneira resumida de se referir à enzima citocromo oxidase, também conhecida como indofenol oxidase. Antigamente, acreditava-se que as enzimas citocromo oxidase e indofenol oxidase eram duas enzimas diferentes, mas hoje são conhecidas por serem as mesmas.

Teste da oxidase: justificativa, procedimento e usos 1

Teste positivo e negativo de oxidase. Fonte: Nenhum autor legível por máquina é fornecido. Alpha.prim ~ commonswiki assumido (com base em reivindicações de direitos autorais). [Domínio público]

Por outro lado, citocromos são hemoproteínas que contêm ferro e completam o sistema do citocromo oxidase. Os citocromos podem variar de uma espécie para outra.

Existem diferentes variedades de citocromos (citocromos a1, a2, a3 e 0). Algumas bactérias podem produzir apenas uma, mas outras até duas ou três por vez. Nesse sentido, a presença do citocromo a e a3 é conhecida como citocromo oxidase c. Este é o tipo de citocromo que detecta o teste da oxidase.

Os gêneros Neisseria e Pseudomonas contêm citocromo oxidase c. Esses gêneros fornecem o teste positivo da oxidase, ajudando a diferenciá-los dos gêneros Acinetobacter e Stenotrophomonas, respectivamente.

Existem também outros gêneros com oxidase positiva.

Fundação

Características do sistema citocromo oxidase c

O sistema do citocromo oxidase c atua da seguinte forma: microorganismos positivos da oxidase usam oxigênio para gerar energia através da respiração aeróbica . Este sistema funciona graças ao transporte de elétrons de substâncias doadoras como NADH + para substâncias receptoras, neste caso oxigênio.

Isso resulta na produção de energia ( ATP ) e água ou peróxido de hidrogênio, dependendo do sistema de citocromo oxidase que o microorganismo possui.

É por isso que a maioria das bactérias oxidase positivas também são positivas para catalase, uma condição necessária para eliminar o peróxido de hidrogênio produzido, uma vez que essa substância é tóxica para as bactérias.

O sistema citocromo oxidase c está presente em algumas bactérias aeróbicas, em certos anaeróbios facultativos, em microaerofílicos raros e em anaeróbios estritos. Este último é compreensível, uma vez que os anaeróbios estritos não podem viver na presença de oxigênio, portanto, não possuem o sistema citocromo oxidase.

Princípio do teste

Neste teste, utiliza substâncias que atuam como aceitadores artificiais de elétrons, substituindo os naturais da cadeia de transporte de elétrons.

São utilizados principalmente corantes como parafenilenodiamina e indofenol, que atuam como receptores de substratos e doadores de elétrons artificiais.

A parafenilenodiamina é oxidada pelo sistema da citocromo oxidase c. O corante na sua forma reduzida é incolor, mas na sua forma oxidada é colorido.

É assim que a presença do sistema da citocromo oxidase c é evidenciada; como uma reação positiva, gerará uma cor lavanda ou azul-púrpura, dependendo do reagente utilizado.

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Por outro lado, se a última substância aceitadora de elétrons na cadeia respiratória for diferente do oxigênio, o teste da oxidase será negativo (sem produção de cor); É o caso de microrganismos anaeróbicos.

Da mesma forma, se o citocromo usado pelo microorganismo for diferente da citocromo oxidase c, também dará o teste negativo.

Procedimento

Para o teste da oxidase, existem vários reagentes e protocolos, todos com a mesma finalidade.

Reagentes

Reagente Kovacs, Gordon e McLeod, Nadi, Carpenter, Suhrland e Morrison e uso de discos de oxidase.

– Reagente de Kovacs oxidase

É formado por 1% de dicloridrato de tetrametil-p-fenilenodiamina.

O reagente de Kovacs é preparado dissolvendo 1 g da substância acima mencionada em 50 ml de água destilada. É sutilmente aquecido até dissolver completamente. Transfira para um frasco âmbar de capacidade suficiente e complete o volume para 100 ml com água destilada. Aguarde pelo menos 15 minutos antes de usar. Armazene em uma geladeira protegida da luz.

É rotulado como reagente Kovacs oxidase, para diferenciá-lo do reagente Kovacs usado para revelar o teste de indol. Este reagente é o mais sensível, menos tóxico, mas mais caro que o restante dos reagentes.

Uma reação positiva será evidente com este reagente com a mudança de cor da colônia para lavanda, que rapidamente se transforma em roxo quase preto. Uma reação negativa é evidenciada porque não há mudança de cor da colônia ou a cor é levemente rosada. O meio também pode escurecer, mas isso não significa uma reação positiva.

Com este reagente, o tempo de reação é crucial, uma reação de cor que ocorre entre 5 a 15 segundos é considerada uma reação positiva.

-Região de Gordon e McLeod

É composto de dicloridrato de dimetil-p-fenilenodiamina, também conhecido como N-dimetil-p-fenilenodiamina ou monohidrocloreto de p-aminodimetilanilina.É preparado como descrito para o reagente Kovacs oxidase, substituindo a substância envolvida.

Este reagente é ligeiramente mais estável que o reagente Kovacs oxidase, embora todos os reagentes contendo p-fenilenodiamina sejam instáveis.

Esta reação é mais tarde, é interpretada como positiva com o aparecimento de uma cor azul-púrpura dentro de 10 a 30 minutos.

-Nadi Reagent

É composto de α-naftol a 1% em álcool etílico (etanol a 95%) e aminodimetilanilina a 1%. A mistura é preparada em partes iguais e usando álcool etílico absoluto como diluente, até a quantidade suficiente para 100 ml.

-Reativo de Carpenter, Suhrland e Morrison

É composto por 1% de oxalato de p-aminodimetilalanina. Prepare da mesma maneira descrita para o reagente Kovacs oxidase, mudando para a substância correspondente.

Com a solução pronta, as tiras de teste são preparadas da seguinte maneira: Tiras de papel de filtro Whatman No. 1, 6-8 cm, são impregnadas com o reagente de 1% de dimetil-p-fenilenodiamina oxalato.

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Eles podem secar sem contato com o metal, armazenar em frascos com dessecante e armazenar em uma geladeira. Essas tiras são estáveis ​​por até 6 meses.

É o reagente mais estável de todos os mencionados, podendo durar em solução por até 6 meses. Outro ponto a favor é que ele não colore o meio ao redor da colônia, se usado diretamente no prato.

A aparência de uma cor vermelha é interpretada como um teste positivo.

Discos de oxidase

São discos comerciais impregnados com reagente para o teste de oxidase. Existem várias marcas comerciais no mercado.

Seu uso é bastante prático, pois não é necessário preparar reagentes novos, o que facilita o trabalho. Os resultados obtidos são confiáveis, desde que os discos sejam adequadamente preservados.

Protocolos

Método de placa direta, método indireto de papel e uso de discos impregnados com reagentes oxidase.

-Método de placa direta

2 ou 3 gotas de qualquer um dos reagentes acima mencionados para este fim são adicionadas diretamente às colônias contidas em uma placa de meio de cultura que não contém glicose.

A mudança ou não da cor das colônias é interpretada, não do meio. O tempo de reação válido depende do reagente utilizado.

– Método indireto no papel

Corte um pedaço de papel de filtro (Whatman No. 1) para um tamanho de 6 cm 2 e coloque dentro de uma placa de Petri vazia.

Adicione 2 ou 3 gotas de reagente Kovacs oxidase ao papel, faça parte da colônia que deseja estudar com uma alça de platina ou bastão de madeira e espalhe-o diretamente sobre o papel impregnado de reagente. Interprete em um intervalo de 5 a 10 segundos.

Com as tiras preparadas com o reagente Carpenter, Suhrland e Morrison, uma colônia é espalhada sobre a tira seca. A mesma tira é usada para testar várias cepas. Interprete em 10 s.

-Discs ( método direto)

Umedeça levemente os discos comerciais com água destilada estéril e sobreponha a colônia a ser estudada. Recomenda-se usar as placas a 35 ° C; se forem usadas em temperatura ambiente ou em placas refrigeradas, a reação será um pouco mais lenta. Interprete a mudança de cor entre 10 e 20 segundos.

Colônias contidas no ágar sangue ou chocolate podem ser usadas.

-Discos (método indireto)

Molhe o disco como descrito acima. Coloque-o em uma placa de Petri vazia. Pegue o suficiente da colônia para estudar com uma alça de platina ou uma vara de madeira e coloque no disco. Interprete a mudança de cor entre 10 e 20 segundos.

Use

O gênero Neisseria e Acinetobacter às vezes se assemelham muito morfologicamente porque, embora o gênero Acinetobacter seja um bacilo Gram negativo, às vezes ele pode assumir a forma de casulo e ser distribuído em pares, simulando o gênero Neisseria.

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Nesse caso, o teste da oxidase é realmente útil. O gênero Neisseria é positivo e Acinetobacter negativo.

No entanto, o gênero Moraxella é muito semelhante ao gênero Neisseria e ambos dão uma reação positiva; É por isso que você sempre deve realizar testes de fermentação de carboidratos para identificação definitiva.

Por outro lado, o teste da oxidase é útil para diferenciar uma bactéria pertencente à família Enterobacteriaceae (todas oxidase negativas) de outros fermentadores, como o gênero Pasteurella, Aeromonas, Plesiomonas (oxidase positiva).

O gênero Vibrio e Helicobacter também são oxidase positiva.

Controle de qualidade

Use cepas conhecidas de Escherichia coli como controle negativo e cepas de Pseudomonas aeruginosa como controle positivo.

Limitações

-Os reagentes devem ser usados ​​recém-preparados, seu prazo de validade em solução à temperatura ambiente é curto porque são muito instáveis. Refrigerado pode durar entre 5 dias a 2 semanas.

-Os reagentes são incolores; se mudarem de cor, devem ser descartados. Os discos danificados são evidenciados porque escurecem com o tempo.

-Uma reação positiva com o reagente Kovacs oxidase entre 15-60 segundos é considerada uma reação retardada e após 60 segundos deve ser considerada negativa.

Haemophylus influenzae produz uma reação oxidase negativa se for utilizado algum reagente com dimetil-p-fenilenodiamina, mas positivo se o reagente Kovacs oxidase (tetrametil-p-fenilenodiamina) for usado.

-Mídia contendo glicose interfere no teste, dando falso negativo.

-As estirpes de Bordetella pertussis podem dar uma reação falsamente positiva se forem provenientes de placas de ágar-sangue altamente concentradas.

-O uso de alças de metal (ferro) produz uma reação falsa positiva.

Recomendações

-Como os reagentes são muito instáveis ​​e tendem a oxidar, recomenda-se congelar alíquotas de 1 a 2 ml e retirá-las conforme necessário.

-Outra maneira de retardar a re-oxidação do reagente é adicionar 0,1% de ácido ascórbico ao preparar os reagentes.

-Como os reagentes são instáveis, é recomendável realizar um controle de qualidade semanalmente.

– Os reagentes que não passam no teste de controle de qualidade não devem ser usados.

Referências

  1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnóstico microbiológico 5a ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
  2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnóstico microbiológico de Bailey & Scott. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
  3. «Teste de oxidase.» Wikipedia, A enciclopédia livre . 15 Jan 2018, 10:32 UTC. 3 de abril de 2019, 14:03 <https://es.wikipedia.org/.
  4. Organização Mundial de Saúde. Manual de laboratório para o teste de identificação e suscetibilidade a antimicrobianos de patógenos bacterianos de importância para a saúde pública no mundo em desenvolvimento 2004. Disponível em: who.int/drugresistance/infosharing
  5. Tiras de teste para o diagnóstico da atividade da oxidase em bactérias. Rev Cubano Med Trop [Internet]. 2000; 52 (2): 150-151.

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