Teste de catalase: justificativa, técnica e usos

O teste da catalase é uma metodologia usada em laboratórios de bacteriologia para destacar a presença da enzima catalase nas bactérias que a possuem. J pique a coloração de Gram são os principais testes que você deve executar os microorganismos recentemente isoladas. Esses testes orientam o microbiologista sobre as etapas a seguir para a identificação definitiva do microrganismo em questão.

Em geral, as bactérias que contêm citocromo possuem a enzima catalase, ou seja, as bactérias aeróbias e anaeróbicas facultativas devem possuí-la. No entanto, existem exceções, como o Streptococcus, que, apesar de serem microrganismos anaeróbicos facultativos, não possuem a enzima catalase.

Teste de catalase: justificativa, técnica e usos 1

Execução do teste de catalase, mostrando uma reação positiva. Fonte: Nenhum autor legível por máquina é fornecido. Nase assumido (com base em reivindicações de direitos autorais). [CC BY-SA 3.0 (http://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0/)]

É por isso que o teste da catalase é usado principalmente para distinguir as famílias Staphylococaceae e Micrococaceae (ambas catalase positiva) da família Streptococaceae (catalase negativa).

Da mesma forma, o gênero Bacillus (catalase positiva) se distingue do gênero Clostridium (catalase negativa), entre outros.

Fundação

A catalase é uma enzima classificada como um hidroperoxidasa, isto significa utilizando como substrato de peróxido de hidrogénio (H 2 O 2 ).

Também é considerada uma oxidoredutase, pois na reação em que participa existe um elemento que serve como doador de elétrons (substância redutora) e outro como receptor de elétrons (substância oxidante).

A catalase é uma proteína que contém um grupo protético com quatro átomos de ferro trivalentes (Fe +++ ), por isso é uma homoproteína. O íon férrico permanece oxidado durante a reação.

Pode-se dizer que a catalase é uma enzima desintoxicante, pois sua função é eliminar as substâncias produzidas durante o metabolismo bacteriano que são tóxicas para as bactérias. Entre essas substâncias está o peróxido de hidrogênio.

O peróxido de hidrogênio é formado pela decomposição dos açúcares pela via aeróbica. Esse processo ocorre da seguinte maneira:

O íon superóxido (O 2 ) ( radical livre) é formado como o produto final da assimilação de glicose pela via aeróbica. Isso é tóxico e é eliminado pela enzima superóxido dismutase que o transforma em oxigênio gasoso e peróxido de hidrogênio.

O peróxido de hidrogênio também é tóxico para as bactérias e deve ser eliminado. A enzima catalase desdobra o peróxido de hidrogênio em água e oxigênio.

A catalase pode atuar em substratos que não sejam peróxido de hidrogênio, como álcoois, aldeídos, ácidos, aminas aromáticas e fenóis. No entanto, o peróxido de hidrogênio também pode ser usado pela catalase para oxidar outros compostos tóxicos, como o álcool metílico e etílico.

Da mesma forma, a catalase está presente nas células fagocíticas, protegendo-a da ação tóxica do peróxido de hidrogênio.

Técnica de teste de rotina de catalase

Método -Slip

Materiais

3% de peróxido de hidrogênio (10 volumes).

Folha de slides

Cabo de plástico descartável ou bastão de madeira.

Procedimento

Tome o suficiente da colônia para estudar sem tocar no ágar de onde vem. A colônia deve ser fresca, ou seja, de uma colheita de 18 a 24 horas.

Coloque a colónia na mesma corrediça seco e adicionar uma gota de peróxido de hidrogénio a 3% (também pode utilizar H 2 O 2 30%). Observe imediatamente se as bolhas são liberadas ou não.

Interpretação

Reação positiva: evolução dos gases, evidenciada pela formação de bolhas (bolhas fortes).

Reação negativa: sem formação de bolhas.

Método direto em cultura pura

Colocar 1 ml de H 2 O 2 a 3% de uma cultura pura ou placas contendo sem manchas de sangue (de preferência nutriente de agar). Observe se há ou não formação de bolhas imediatamente. É também possível usar H 2 O 2 30%.

É interpretado da mesma forma que o método de suporte a objeto.

-Método com tubo capilar ou Fung e Petrishko

Encha um tubo capilar de 67 mm a uma altura de 20 mm com peróxido de hidrogênio a 3% por capilaridade.

Toque na colônia isolada que você deseja estudar com o capilar preenchido com 3% de H 2 O 2 . Observe se o capilar se enche de bolhas em aproximadamente 10 segundos. Este método permite semi-quantificar a reação em cruzamentos:

Sem cruzes não há bolhas (reação negativa).

+ –—- Poucas bolhas (reação fraca ou retardada).

++ – Bolhas abundantes (reação moderada).

+++ – As bolhas atingem o extremo oposto (reação energética).

-Taylor e Achanzar para testes de catalase que dão resultados duvidosos

Em uma lâmina de vidro limpa, seca colocada uma colónia isolada, em seguida, colocar uma gota de H 2 O 2 a 0,5% e cobrir com uma lamela. Observe se há ou não formação de bolhas presas.

Interpretação: a presença de bolhas indica uma reação positiva. Sem bolhas, é interpretado como uma reação negativa.

Teste de catalase para espécies de Mycobacterium

Essa técnica precisa ser feita controlando o pH e a temperatura. Ele deve ser executado sob uma cobertura de fluxo laminar, pois a manipulação das diferentes espécies de Mycobacterium é perigosa.

-Materiais

30% de peróxido de hidrogênio ou 110 volumes (superoxal).

Tampão de Fosfato pH 7

Tween 80 a 10%

Cultura de Mycobacterium em cunha 3 a 4 semanas

-Preparação de reagentes

Tampão de Fosfato pH 7

Pesar:

1,361 g de (KH 2 PO 4 ) fosfato monopotássico anidro.

1.420 g de fosfato dissódico anidro (Na2HPO3).

Dissolva ambos os sais em um pouco de água destilada estéril e complete com água até 1000 ml.

Tween 80 a 10%

Faça uma diluição 1:10 para o Tween 80 comercialmente concentrado, para fazer isso, faça o seguinte:

Tome 1 ml de Tween 80 e coloque-o em um pouco de água destilada, dissolva e complete o volume com água até 10 ml.

Reagente final

Misture uma quantidade de tampão fosfato com uma quantidade de Tween 80 a 10% (em partes iguais). Defina no laboratório quanto você deseja preparar.

-Procedimento

Coloque 5 ml de tampão fosfato em um tubo de ensaio estéril com uma tampa de rosca (baquelite).

Com uma alça de inoculação, pegue uma colônia suficiente de uma cunha semeada em Mycobacterium e dissolva-a no tampão fosfato.

Cubra o tubo sem apertar demais a linha. Coloque em banho-maria a 68 ° C por 20 a 30 minutos. Retire e deixe esfriar a 22-25 ° C

Meça 0,5 ml do reagente final (mistura) e adicione-o ao tubo com a solução fria. Observe a formação ou não de bolhas.

É interpretado da mesma forma que as técnicas anteriores.

Use

Quando um crescimento de colônia é obtido em meio enriquecido, uma coloração de Gram e um teste de catalase devem ser realizados nas colônias obtidas. Isso orientará o microbiologista sobre os procedimentos a serem seguidos para identificação definitiva.

Teste de catalase: justificativa, técnica e usos 2

Fonte: Elaborado pelo autor MSc. Marielsa Gil

Controle de qualidade

Para avaliar o bom funcionamento do reagente de peróxido de hidrogênio, use cepas de controle recém-cultivadas, como Staphylococcus aureus como controle positivo e Streptococcus sp como controle negativo.

Outra alternativa que serve como controle positivo é colocar uma gota de peróxido de hidrogênio no ágar sanguíneo; os eritrócitos possuem catalase; portanto, haverá uma borbulhagem se o reagente estiver em boas condições.

Um agar de chocolate pode ser usado como controle negativo, aqui os eritrócitos já estão lisados ​​e o teste é negativo.

Limitações

-Não use culturas antigas para o teste, pois isso pode causar falsos negativos.

-Evite tomar colônias de culturas em ágar sangue, se for tomado cuidado para não tocar no ágar; Este procedimento pode causar falsos positivos, uma vez que os eritrócitos contêm catalase.

-Se você tomar a colônia com uma alça de platina, não inverta a ordem do procedimento, pois isso pode gerar falsos positivos. Isso ocorre porque a platina é capaz de reagir com peróxido de hidrogênio, causando bolhas.

-Não use o reagente de peróxido de hidrogênio se for muito antigo, pois o reagente é muito instável e tende a se decompor ao longo do tempo.

-Manter o reagente de peróxido de hidrogênio protegido da luz e na refrigeração para evitar danos.

-Faça um controle de qualidade do reagente de peróxido de hidrogênio sempre que for usado.

-Tendo em consideração que se a H é usado 2 O duas reacções de 30% são mais fortes do que as feitas com H 2 O 2 a 3%.

Referências

  1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnóstico microbiológico 5a ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
  2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnóstico microbiológico de Bailey & Scott. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
  3. Mac Faddin J. (2003). Testes bioquímicos para a identificação de bactérias de importância clínica. 3rd ed. Editora Panamericana. Bons ares. Argentina
  4. Laboratórios BD Reagente Catalase-Gotario. Disponível em: http://winklerltda.cl
  5. Laboratórios Vadechemical. Água oxigenada. Equivalência entre volumes e porcentagem. Disponível em: vadequimica.com

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