Ágar EMB: fundação, preparação e uso

O agar EMB é um diferencial selectivo e meio utilizado para o isolamento de cultura sólido de bacilos Gram negativas, principalmente da família Enterobacteriaceae, e outras bactérias Gram negativas pouco exigente. Também é conhecido pelo acrônimo EAM, que significa azul de eosina-metileno.

Este meio foi criado por Holt-Harris e Teague em 1916. Contém peptona, lactose, sacarose, fosfato dipotássico, ágar, eosina, azul de metileno e água. É muito semelhante ao ágar MacConkey, especialmente se o ágar EMB modificado por Levine, que não contém sacarose, for usado.

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Brilho metálico de Escherichia coli no ágar EMB Fonte: Carmen Moreno González [CC BY-SA 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0)], de Wikimedia Commons

De fato, cada laboratório decide se trabalha com um ou outro, pois cumpre a mesma função, mesmo que sejam bioquimicamente diferentes.

Ele ainda tem a mesma desvantagem do ágar MacConkey clássico em termos de produção de enxames pelo gênero Proteus. Portanto, para evitar esse fenômeno, a concentração do ágar pode ser aumentada em até 5%.

Fundação

Seletiva

O ágar EMB é sutilmente seletivo porque contém corantes de anilina (eosina e azul de metileno), que atuam como inibidores, impedindo o crescimento da maioria das bactérias Gram-positivas e de alguns bacilos Gram-negativos exigentes.

No entanto, este ágar tem a desvantagem de que algumas bactérias Gram-positivas podem resistir à presença de substâncias inibidoras e crescer como pequenas colônias pontuais incolores, como Enterococcus faecalis e alguns Staphylococcus .

Certas leveduras também podem crescer, como o complexo de Candida albicans , que dará colônias rosa muito pequenas. Até clamidosporos podem ser desenvolvidos a partir desta levedura se a amostra for semeada em profundidade.

Diferencial

Por outro lado, o ágar EMB também é um meio diferencial, uma vez que esses corantes juntos (eosina e azul de metileno) têm a propriedade de formar um precipitado em pH ácido, servindo como indicadores de sua produção.

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Portanto, bactérias de lactose ou sacarose que fermentam pouco produzem colônias roxas em 24 a 48 horas. Por exemplo, os gêneros Klebsiella, Enterobacter e Serratia.

As bactérias que fermentam fortemente a lactose, como Escherichia coli, ou sacarose, como Yersinia enterocolitica ou Proteus penneri, formam um precipitado esverdeado preto, dando uma aparência característica de brilho metálico nessas espécies.

Note-se que, se for utilizado o meio de levina EMB (sem sacarose), Yersinia enterocolitica e Proteus penneri produzirão colônias transparentes.

As bactérias que não fermentam lactose ou sacarose são nutridas pela presença de peptonas, que fornecem os aminoácidos e nitrogênio necessários ao desenvolvimento bacteriano e produzem colônias transparentes. Por exemplo, os gêneros Salmonella e Shigella, entre outros.

Da mesma forma, é importante enfatizar que o gênero Acinetobacter pode apresentar colônias de lavanda azul, mesmo que não seja fermentador de lactose, nem sacarose, mas possui a propriedade de fixar o azul de metileno em sua parede celular. Isso também pode acontecer com outras bactérias oxidativas.

Preparação

O meio desidratado original é bege claro.

Para preparar este meio de cultura, 36 gramas do meio desidratado devem ser pesados ​​e suspensos em um frasco para injetáveis ​​contendo um litro de água destilada.

Depois de deixar a mistura em repouso por 5 minutos, leve a fiola a uma fonte de calor, misturando vigorosamente e constantemente até ferver e dissolver completamente.

Posteriormente, o meio de cultura já dissolvido deve ser esterilizado usando a autoclave a 121 ° C por 15 minutos.

Após o tempo, ele é removido da autoclave e deixado descansar brevemente. Em seguida, é servido mesmo quente (45-50 ° C) entre 15 a 20 ml de ágar em cada placa de Petri estéril. O meio deve ser azul tornassol.

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Depois de servir, os pratos são deixados levemente descobertos até o ágar esfriar um pouco. Eles são cobertos e deixados solidificar completamente. Posteriormente, eles são pedidos em um suporte de placa invertido e armazenados em uma geladeira (8 ° C) até o uso.

Esse procedimento é preferencialmente realizado em uma cobertura de fluxo laminar ou em frente ao queimador de Bunsen para evitar contaminação.

É importante ter em mente que cada casa comercial indicará a quantidade a pesar para preparar o meio de cultura.

O pH final do meio deve ser 7,2 ± 0,2

Usos

Este meio é usado para semear urina e fezes ou qualquer tipo de amostra clínica, especialmente se houver suspeita de presença de bacilos Gram-negativos não exigentes, como bacilos pertencentes à família Enterobacteriaceae, que cresce muito bem nesse meio.

As bactérias enteropatogênicas dos gêneros Shigella e Salmonella são diferenciadas por suas colônias incolores ou levemente âmbar.

Outros bacilos de lactose não fermentativos, como Aeromonas, Pseudomonas, Acinetobacter, entre outros, também crescem.

Da mesma forma, esse meio é muito útil na análise microbiológica de alimentos e água, pois é ideal para a fase confirmatória completa da determinação de coliformes, ou seja, para corroborar a presença de E. coli de caldos CE turvos, de da técnica numérica mais provável (NMP).

Controle de qualidade

Para verificar se o meio de cultura preparado na hora funciona bem, é possível semear cepas de controle para observar as características das colônias e verificar se elas dão como esperado.

Para isso , podem ser utilizadas cepas ATCC ou cepas bem identificadas de E. coli , Enterobacter aerogenes , Klebsiella sp , Salmonella typhimurium , Shigella flexneri , Pseudomonas aeruginosa e algumas bactérias Gram-positivas, como S. aureus .

Espera-se que E. coli gere colônias negras azuladas bem desenvolvidas com brilho metálico verde.Enquanto isso, Enterobacter aerogenes e Klebsiella sp devem fornecer colônias mucosas bem desenvolvidas em preto azulado.

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Por outro lado, Salmonella typhimurium e Shigella flexneri , devem desenvolver colônias grandes, incolores ou com uma ligeira cor âmbar.

Finalmente, o gênero Pseudomonas aeruginosa cresce como colônias incolores de tamanho irregular, enquanto as bactérias Gram-positivas devem ser totalmente inibidas ou crescer mal com colônias muito pequenas.

Considerações finais

Às vezes, a esterilização faz com que o azul de metileno encolha, com uma cor laranja média sendo observada. Para que o azul de metileno oxide e recupere a cor púrpura, ele deve ser misturado suavemente até que a cor seja recuperada.

Além disso, após a esterilização, o corante pode precipitar, portanto deve ser bem misturado antes de servir as placas de Petri.

Referências

  1. Camacho A, Giles M, Ortegón A, Palao M, Serrano B e Velázquez O. 2009. Técnicas de análise microbiológica de alimentos. 2nd ed. Faculdade de Química, UNAM. México
  2. Carranza C, León R, Falcón N, Neumann A, Kromm C. Caracterização e distribuição de cepas potencialmente patogênicas de Escherichia coli de frangos de corte de aves domésticas no Peru. Rev. Invest. veterinário Peru 2012 23 (2): 209-219. Disponível em: scielo.org.
  3. Laboratórios Conda SA Agar com Eosina e Azul de Metileno. 2010. Disponível em: condalab.com
  4. Laboratórios britânicos. Levine EMB (Com Eosina e Azul de Metileno) 2011. Disponível em: britanialab.com
  5. Laboratórios BD Agar BD EMB (Agar Eosina Azul de Metileno), Modificado. 2013. Disponível em: bd.com
  6. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnóstico microbiológico (5ª ed.). Argentina, Editorial Panamericana SA
  7. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Diagnóstico microbiológico de Bailey & Scott. 12 ed. Argentina Editorial Panamericana SA

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