O agar EMB é um diferencial selectivo e meio utilizado para o isolamento de cultura sólido de bacilos Gram negativas, principalmente da família Enterobacteriaceae, e outras bactérias Gram negativas pouco exigente. Também é conhecido pelo acrônimo EAM, que significa azul de eosina-metileno.
Este meio foi criado por Holt-Harris e Teague em 1916. Contém peptona, lactose, sacarose, fosfato dipotássico, ágar, eosina, azul de metileno e água. É muito semelhante ao ágar MacConkey, especialmente se o ágar EMB modificado por Levine, que não contém sacarose, for usado.
De fato, cada laboratório decide se trabalha com um ou outro, pois cumpre a mesma função, mesmo que sejam bioquimicamente diferentes.
Ele ainda tem a mesma desvantagem do ágar MacConkey clássico em termos de produção de enxames pelo gênero Proteus. Portanto, para evitar esse fenômeno, a concentração do ágar pode ser aumentada em até 5%.
Fundação
Seletiva
O ágar EMB é sutilmente seletivo porque contém corantes de anilina (eosina e azul de metileno), que atuam como inibidores, impedindo o crescimento da maioria das bactérias Gram-positivas e de alguns bacilos Gram-negativos exigentes.
No entanto, este ágar tem a desvantagem de que algumas bactérias Gram-positivas podem resistir à presença de substâncias inibidoras e crescer como pequenas colônias pontuais incolores, como Enterococcus faecalis e alguns Staphylococcus .
Certas leveduras também podem crescer, como o complexo de Candida albicans , que dará colônias rosa muito pequenas. Até clamidosporos podem ser desenvolvidos a partir desta levedura se a amostra for semeada em profundidade.
Diferencial
Por outro lado, o ágar EMB também é um meio diferencial, uma vez que esses corantes juntos (eosina e azul de metileno) têm a propriedade de formar um precipitado em pH ácido, servindo como indicadores de sua produção.
Portanto, bactérias de lactose ou sacarose que fermentam pouco produzem colônias roxas em 24 a 48 horas. Por exemplo, os gêneros Klebsiella, Enterobacter e Serratia.
As bactérias que fermentam fortemente a lactose, como Escherichia coli, ou sacarose, como Yersinia enterocolitica ou Proteus penneri, formam um precipitado esverdeado preto, dando uma aparência característica de brilho metálico nessas espécies.
Note-se que, se for utilizado o meio de levina EMB (sem sacarose), Yersinia enterocolitica e Proteus penneri produzirão colônias transparentes.
As bactérias que não fermentam lactose ou sacarose são nutridas pela presença de peptonas, que fornecem os aminoácidos e nitrogênio necessários ao desenvolvimento bacteriano e produzem colônias transparentes. Por exemplo, os gêneros Salmonella e Shigella, entre outros.
Da mesma forma, é importante enfatizar que o gênero Acinetobacter pode apresentar colônias de lavanda azul, mesmo que não seja fermentador de lactose, nem sacarose, mas possui a propriedade de fixar o azul de metileno em sua parede celular. Isso também pode acontecer com outras bactérias oxidativas.
Preparação
O meio desidratado original é bege claro.
Para preparar este meio de cultura, 36 gramas do meio desidratado devem ser pesados e suspensos em um frasco para injetáveis contendo um litro de água destilada.
Depois de deixar a mistura em repouso por 5 minutos, leve a fiola a uma fonte de calor, misturando vigorosamente e constantemente até ferver e dissolver completamente.
Posteriormente, o meio de cultura já dissolvido deve ser esterilizado usando a autoclave a 121 ° C por 15 minutos.
Após o tempo, ele é removido da autoclave e deixado descansar brevemente. Em seguida, é servido mesmo quente (45-50 ° C) entre 15 a 20 ml de ágar em cada placa de Petri estéril. O meio deve ser azul tornassol.
Depois de servir, os pratos são deixados levemente descobertos até o ágar esfriar um pouco. Eles são cobertos e deixados solidificar completamente. Posteriormente, eles são pedidos em um suporte de placa invertido e armazenados em uma geladeira (8 ° C) até o uso.
Esse procedimento é preferencialmente realizado em uma cobertura de fluxo laminar ou em frente ao queimador de Bunsen para evitar contaminação.
É importante ter em mente que cada casa comercial indicará a quantidade a pesar para preparar o meio de cultura.
O pH final do meio deve ser 7,2 ± 0,2
Usos
Este meio é usado para semear urina e fezes ou qualquer tipo de amostra clínica, especialmente se houver suspeita de presença de bacilos Gram-negativos não exigentes, como bacilos pertencentes à família Enterobacteriaceae, que cresce muito bem nesse meio.
As bactérias enteropatogênicas dos gêneros Shigella e Salmonella são diferenciadas por suas colônias incolores ou levemente âmbar.
Outros bacilos de lactose não fermentativos, como Aeromonas, Pseudomonas, Acinetobacter, entre outros, também crescem.
Da mesma forma, esse meio é muito útil na análise microbiológica de alimentos e água, pois é ideal para a fase confirmatória completa da determinação de coliformes, ou seja, para corroborar a presença de E. coli de caldos CE turvos, de da técnica numérica mais provável (NMP).
Controle de qualidade
Para verificar se o meio de cultura preparado na hora funciona bem, é possível semear cepas de controle para observar as características das colônias e verificar se elas dão como esperado.
Para isso , podem ser utilizadas cepas ATCC ou cepas bem identificadas de E. coli , Enterobacter aerogenes , Klebsiella sp , Salmonella typhimurium , Shigella flexneri , Pseudomonas aeruginosa e algumas bactérias Gram-positivas, como S. aureus .
Espera-se que E. coli gere colônias negras azuladas bem desenvolvidas com brilho metálico verde.Enquanto isso, Enterobacter aerogenes e Klebsiella sp devem fornecer colônias mucosas bem desenvolvidas em preto azulado.
Por outro lado, Salmonella typhimurium e Shigella flexneri , devem desenvolver colônias grandes, incolores ou com uma ligeira cor âmbar.
Finalmente, o gênero Pseudomonas aeruginosa cresce como colônias incolores de tamanho irregular, enquanto as bactérias Gram-positivas devem ser totalmente inibidas ou crescer mal com colônias muito pequenas.
Considerações finais
Às vezes, a esterilização faz com que o azul de metileno encolha, com uma cor laranja média sendo observada. Para que o azul de metileno oxide e recupere a cor púrpura, ele deve ser misturado suavemente até que a cor seja recuperada.
Além disso, após a esterilização, o corante pode precipitar, portanto deve ser bem misturado antes de servir as placas de Petri.
Referências
- Camacho A, Giles M, Ortegón A, Palao M, Serrano B e Velázquez O. 2009. Técnicas de análise microbiológica de alimentos. 2nd ed. Faculdade de Química, UNAM. México
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