Caldo de malonato: justificativa, preparação e usos

O caldo de malonato é o meio de cultura líquido utilizado para o teste de diagnóstico (malonato), usado para diferenciar alguns géneros da família Enterobacteriaceae. Foi criado por Leifson em 1933 e posteriormente modificado por Ewing, que adicionou uma pequena quantidade de dextrose e extrato de levedura à fórmula original.

Atualmente, o meio consiste em extrato de levedura, sulfato de amônio, fosfato dipotássico, fosfato monopotássico, cloreto de sódio, malonato de sódio, dextrose e azul de bromotimol. Este teste é geralmente incluído na bateria bioquímica de identificação de Enterobactérias, ajudando a diferenciar certos gêneros e espécies.

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Representação gráfica do teste de malonato. A. Teste negativo, B. (acidificação) Teste negativo, C. (alcalinização do meio) Teste positivo. Fonte: tubos coloridos publicdomainpictures.net

O teste do malonato baseia-se principalmente na capacidade de alguns microrganismos de usar o malonato de sódio como única fonte de carbono e como fonte de nitrogênio do sulfato de amônio.

O teste de malonato é geralmente positivo em algumas espécies dos gêneros Enterobacter, Klebsiella e Citrobacter. Enquanto isso, a maioria das espécies dos gêneros Escherichia, Salmonella, Shigella, Edwardsiella, Yersinia, Serratia, Morganella, Proteus e Providencia, apresentam uma reação negativa.

Fundação

O teste de malonato consiste em evidenciar as bactérias capazes de usar o malonato de sódio como única fonte de carbono e o sulfato de amônio como fonte de nitrogênio.

A maioria das enterobactérias que não usam malonato são capazes de crescer nesse ambiente, tendo como dextrose e extrato de levedura como nutrientes.

Nesse caso, qualquer tentativa de alcalinização pelo uso de peptons será neutralizada pela produção de ácidos gerados pela fermentação da dextrose. Da mesma forma, os fosfatos de dipotássio e monopotássio atuam como um tampão, mantendo o pH em 6,7.

É por isso que, quando o teste é negativo, o caldo é da mesma cor original (verde). Em raras ocasiões, o meio pode se acidificar devido à fermentação da dextrose; Sem o uso das peptonas, o indicador de pH mudaria a cor do meio para amarelo. Para que isso aconteça, o pH deve cair para 6.

Agora, quando esse teste é positivo, diz-se que o microorganismo usou o malonato e o sulfato de amônio como fontes de carbono e nitrogênio, respectivamente, sem fazer uso dos outros componentes.

Nesse caso, o meio é alcalinizado devido à liberação de sódio e à consequente formação de NaOH. Nesse sentido, o indicador de pH (azul de bromotimol) muda a cor do meio de verde para azul quando o pH é igual ou superior a 7,6. O azul pode ser claro ou intenso (azul da Prússia).

Finalmente, o cloreto de sódio mantém a osmolaridade do meio e a água é o diluente de todos os componentes.

Interpretação

Caldo da mesma cor (verde): teste negativo

Caldo amarelo: teste negativo

Caldo azul claro ou intenso: teste positivo

Existe uma variante chamada caldo de malonato de fenilalanina, também chamada meio Shaw e Clarke. Nesse caso, dois testes podem ser analisados, o uso de malonato como fonte de carbono e a produção de ácido pirúvico a partir da fenilalanina.

Preparação

Caldo Malonate

A quantidade de gramas especificada pelo folheto da casa comercial escolhida é pesada (pode variar de uma para outra). Gramas pesados ​​são suspensos em um litro de água destilada. Aqueça levemente até dissolver completamente. Distribua 3 ml do meio nos tubos de ensaio 13/100 com tampa de algodão.

Esterilizar em autoclave a 121 ° C por 15 ou 20 minutos.

Deixe esfriar antes de usar. Se eles não forem usados ​​imediatamente, guarde na geladeira até o uso. Traga os caldos à temperatura ambiente antes de inoculá-los.

O pH do meio deve ser 6,7 ± 0,2. A cor do meio preparado é verde garrafa.

Caldo de malonato de fenilalanina

Pesar 11 g do meio desidratado e dissolver em 1 litro de água destilada. O restante da preparação é igual ao descrito acima.

Também pode ser preparado adicionando 2 g / L de fenilalanina ao meio de caldo de malonato antes de ser esterilizado.

Use

É usado como parte da bateria de testes bioquímicos montados para a identificação de bactérias da família Enterobacteriaceae.

Ajuda a distinguir entre:

-O gênero Klebsiella e Enterobacter (+) do gênero Escherichia e Serratia (-).

-As espécies de Salmonella enterica ssp arizonae , Salmonella enterica ssp salame e Salmonella enterica ssp diarizonae (+), das espécies Salmonella enterica ssp enterica (-).

-O gênero Klebsiella geralmente (+) do gênero Actinobacillus (-).

-Em algumas ocasiões, pode ajudar na diferenciação de gêneros e espécies de bactérias não pertencentes à família Enterobacteriaceae, como entre bacilos Gram-negativos não fermentativos Alcaligenes faecalis (+) e Acinetobacter sp (-).

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Fonte: Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnóstico microbiológico 5a ed. Editorial Panamericana SA Argentina.

Procedimento

Sob um isqueiro, uma porção de uma colônia pura é retirada, usando uma alça de platina devidamente esterilizada e resfriada. A amostra colhida (inóculo leve) se dissolve no caldo de malonato. Incubar com a tampa solta na aerobiose a 35 ° C ± 0,2 por 24 a 48 horas.

O caldo de malonato também pode ser inoculado a partir de uma cultura de 18 a 24 horas em caldo de soja tripticase. Neste caso, são tomados 0,01 ml com uma pipeta estéril e o caldo de malonato é inoculado. Incubar com a tampa solta na aerobiose a 35 ° C ± 0,2 por 24 a 48 horas.

Após o tempo, os resultados são interpretados. Qualquer vestígio de azul que culminou após 48 horas de incubação deve ser considerado positivo. O teste não deve ser interpretado como negativo até que o tempo de incubação de 48 horas seja cumprido.

No caso de usar a variante do caldo de malonato de fenilalanina, o malonato é interpretado primeiro e depois são adicionadas 5 gotas de HCL 1N e 3-5 gotas de cloreto férrico a 8%. Uma cor verde escura é interpretada como um teste positivo para fenilalanina. Se, em vez disso, o meio ficar azul claro, o teste será negativo para a fenilalanina.

Controle de qualidade

Para realizar o controle de esterilidade do meio, um ou dois caldos devem ser incubados a 35 ° C ± 0,2 por 24 horas de incubação. Após esse período, não deve haver turbidez ou alteração de cor.

Cepas conhecidas ou certificadas podem ser usadas para controle de qualidade, como: Enterobacter aerogenes ATCC 13048, Klebsiella pneumoniae ATCC 33945, Salmonella enteric ssp arizonae ATCC 13314 e Escherichia coli ATCC 25922.

Os resultados esperados são:

  • Enterobacter aerogenes , Klebsiella pneumoniae e Salmonella enteric ssp arizonae dão uma reação positiva (cor azul média).
  • Para Escherichia coli, o resultado deve ser negativo, ou seja, espera-se que não haja mudança de cor (verde) ou que fique amarelo devido à fermentação da glicose.

Limitações

Não use caldos que mostrem turbidez, precipitados, mudança de cor ou qualquer sinal de deterioração.

Referências

  1. Pedraza J, Sanandres N, Varela Z, Aguirre E, Camacho J. Isolamento microbiológico de Salmonella spp . e ferramentas moleculares para detecção. Uninorte saúde. Barranquilla (Col.) 2014; 30 (1): 73-94. Disponível em: scielo.org.co
  2. BBL Caldo de malonato, Ewing modificado. 2007. Disponível em: bd.com
  3. Laboratórios Senna Caldo de Malonato. Disponível em: cientificasenna.com
  4. RenyLab Caldo de Malonato. 2013. Disponível em: es.renylab.ind.br
  5. Mbiolog Diagnostics. Caldo de Malonato. Disponível em: mbiolog.com
  6. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnóstico microbiológico 5a ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
  7. Laboratórios Conda Pronadisa. Caldo de malonato de fenilalanina. Disponível em: condalab.com

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