Coloração Giemsa: fundação, materiais, técnica e usos

O corante de Giemsa é um tipo de coloração de amostras clínicas, com base na mistura de corantes ácidos e básicos. Sua criação foi inspirada no trabalho de Romanowsky, onde Gustav Giemsa, químico e bacteriologista da Alemanha, o aperfeiçoou adicionando glicerol para estabilizar os compostos.

As alterações geradas na técnica original de Romanowsky nos permitiram melhorar consideravelmente as observações microscópicas; portanto, a técnica foi denominada coloração de Giemsa.

Coloração Giemsa: fundação, materiais, técnica e usos 1

Várias amostras coradas com Giemsa Stain. A. Trypanosoma evansi no sangue periférico. B. Células sanguíneas normais. C. Borrelia theileri no sangue periférico. D. Linfoma de Burkitt.

Por ser uma técnica simples de executar, altamente funcional e econômica, atualmente é amplamente utilizada no laboratório clínico para esfregaços hematológicos, amostras de medula óssea e seções de tecidos.

A técnica de coloração por Giemsa é muito útil para estudos citológicos, pois permite a observação de estruturas celulares específicas.Essa técnica mancha os citoplasmas, núcleos, nucléolos, vacúolos e grânulos das células, sendo capaz de distinguir traços finos de cromatina.

Além disso, podem ser detectadas alterações significativas no tamanho, forma ou coloração do núcleo, onde é possível visualizar a perda da relação núcleo-citoplasma.

Por outro lado, permite identificar células imaturas na medula óssea e no sangue periférico, sendo importante para o diagnóstico de doenças graves como a leucemia. Também é possível detectar hemoparasitas, bactérias extras e intracelulares, fungos, entre outros.

Na citogenética, é amplamente utilizado, pois é possível estudar a mitose das células.

Fundação de coloração Giemsa

Os corantes do tipo Romanowsky baseiam-se no uso de um contraste entre os corantes ácidos e básicos, para colorir as estruturas básicas e ácidas, respectivamente. Como pode ser visto, existe uma afinidade dos corantes ácidos para manchar as estruturas básicas e vice-versa.

O corante básico usado é o azul de metileno e seus derivados oxidados (Azure A e Azure B), enquanto o corante ácido é a eosina.

As estruturas ácidas das células são ácidos nucleicos, grânulos de basófilos segmentados, entre outros, para que sejam corados com azul de metileno.

Nesse mesmo sentido, as estruturas básicas das células são a hemoglobina e alguns grânulos, como os contidos nos eosinófilos segmentados, entre outros; Estes serão tingidos com eosina.

Por outro lado, como o azul de metileno e o azul celeste são caracterizados como corantes metacromáticos, eles podem fornecer um tom variável às diferentes estruturas de acordo com a carga de polianiões que possuem.

É assim que a combinação estratégica de corantes básicos e ácidos consegue desenvolver um amplo espectro de cores, de acordo com as características bioquímicas de cada estrutura, passando por tons de azul pálido, azul escuro, lilás e roxo no caso de estruturas ácidas.

Enquanto a cor fornecida pela eosina é mais estável, gera cores entre laranja avermelhado e salmão.

Materiais

Materiais para a preparação da solução-mãe

A preparação da solução-mãe requer pesar 600 mg de corante em pó Giemsa, medindo 500 ml de álcool metílico sem acetona e 50 ml de glicerina neutra.

Modo de preparação da solução-mãe

Coloque o pó pesado de Giemsa em uma argamassa. Se houver caroços, eles devem ser pulverizados. Em seguida, adicione uma quantidade apreciável da glicerina medida e misture muito bem. A mistura obtida é vertida em um frasco âmbar muito limpo.

O restante da glicerina é colocado na argamassa. Misture novamente para limpar o restante corante que foi colado nas paredes da argamassa e coloque na mesma garrafa.

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A garrafa é coberta e transportada por 2 horas em banho-maria a 55 ° C.Enquanto estiver em banho-maria, mexa levemente a mistura a cada meia hora.

Posteriormente, a mistura é deixada esfriar para colocar o álcool. Anteriormente, uma parte do álcool medido é colocada na argamassa para terminar de lavar o corante restante e depois adicionada à mistura junto com o restante do álcool.

Esta preparação deve deixar amadurecer por pelo menos 2 semanas. A parte usada na solução-mãe deve ser filtrada.

Para evitar a contaminação da preparação, recomenda-se passar a parte que estará em uso constante para uma pequena garrafa de âmbar com conta-gotas. Reabasteça cada vez que o reagente estiver esgotado.

Materiais para preparar a solução tampão

Por outro lado, uma solução tampão a pH 7,2 é preparada da seguinte maneira:

6,77 g de fosfato de sódio (anidro) (pesava NaHPO 4 ), 2,59 g de di-hidrogenofosfato de potássio (KH 2 PO 4 ), e água destilada até 1000 ml.

Preparação final do corante

Para a preparação da solução final de coloração, medem-se 2 ml da solução-mãe filtrada e misturam-se com 6 ml da solução tampão. A mistura é agitada.

Um fato relevante que deve ser levado em consideração é que as técnicas de preparação de corantes podem mudar de acordo com a instalação comercial.

Materiais adicionais necessários para fazer a coloração

Além dos materiais descritos, deve haver pontes coloridas, camisetas com água ou tampão para lavar roupa, lençóis com objetos ou capas, um cronômetro para controlar o tempo de coloração e borrar o papel ou algum material que sirva para secar ( gaze ou algodão).

Técnica

Processo de coloração

1) Antes da coloração, a amostra deve ser espalhada em uma lâmina limpa.

As amostras podem ser sangue, medula óssea, cortes de tecido histológico ou amostras cervical-vaginais. Recomenda-se que as pastas sejam finas e tenham 1 ou 2 horas de secagem antes da coloração.

2) Em uma ponte para colorir são colocadas todas as folhas que têm cor. Sempre funciona na mesma ordem e cada folha está bem identificada.

3) Coloque algumas gotas de álcool metílico a 100% (metanol) no esfregaço e deixe por 3 a 5 minutos para fixar e desidratar a amostra.

4) Descarte o metanol presente na folha e deixe secar ao ar.

5) Depois de seco, coloque a solução final de coloração com um conta-gotas até que toda a folha esteja coberta. Deixe por 15 minutos. Alguns autores recomendam até 25 min. Depende da casa comercial.

6) Drene o corante e lave o esfregaço com água destilada ou com uma solução tampão em 7.2.

7) Em papel absorvente, deixe as folhas secar ao ar livre, dispostas verticalmente com a ajuda de um suporte.

8) Limpe a parte de trás da lâmina com uma gaze ou cotonete embebido em álcool para remover qualquer corante.

Utilitários

A técnica de coloração Giemsa é usada em várias áreas, incluindo: hematologia, micologia, bacteriologia, parasitologia, citologia e citogenética.

Hematologia

É o utilitário mais frequente dado a essa coloração. Com ele, todas e cada uma das células presentes na medula óssea ou em amostras de sangue periférico podem ser identificadas. Além de estimar o número de cada série, é possível detectar leucocitose ou leucopenia, trombocitopenia, etc.

Por ser sensível à identificação de células imaturas, é relevante no diagnóstico de leucemia aguda ou crônica. Também é possível fazer o diagnóstico de anemias, como doença falciforme, doença falciforme, entre outras.

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Micologia

Nesta área, é comum o uso de Histoplasma capsulatum (fungo dimórfico intracelular) em amostras de tecido.

Bacteriologia

Em esfregaços hematológicos corados com Giemsa, é possível detectar Borrelias sp em pacientes com a doença chamada febre recorrente. Os espiroquetas são abundantemente observados entre os eritrócitos, em amostras colhidas no pico febril.

Também é possível visualizar bactérias intracelulares como Rickettsias sp e Chlamydia trachomatis em células infectadas.

Parasitologia

No campo da parasitologia, a coloração de Giemsa permitiu o diagnóstico de doenças parasitárias como malária, doença de chagas e leishmaniose.

Nos dois primeiros parasitas, Plasmodium sp e Trypanosoma cruzi, respectivamente, podem ser visualizados no sangue periférico de pacientes infectados, podendo ser encontrados em vários estágios de acordo com o estágio em que a doença se encontra.

Para melhorar a busca de parasitas no sangue, recomenda-se o uso da mancha Giemsa misturada ao corante May-Grünwald.

Da mesma forma, a leishmaniose cutânea pode ser diagnosticada através da avaliação de amostras de biópsias de pele coradas com Giemsa, onde o parasita é encontrado.

Citologia

A coloração de Giemsa também é usada para o estudo citológico de amostras endocervicais, embora não seja a técnica mais utilizada para esse fim.

Porém, nos casos de escassez de recursos, ele pode ser usado, com uma funcionalidade semelhante à oferecida pelo exame de Papanicolaou e a um custo menor. No entanto, requer conhecimentos do examinador.

Citogenética

Uma característica relevante da coloração de Giemsa é sua capacidade de se ligar fortemente às regiões do DNA ricas em adenina e timina. Isso permite que o DNA seja visualizado durante a mitose das células, em diferentes estados de condensação.

Esses estudos são necessários para detectar aberrações cromáticas, como duplicações, deleções ou translocações das diferentes regiões dos cromossomos.

Pesquisa demonstrando a eficácia da coloração Giemsa

Cannova et al (2016), compararam três técnicas de coloração para o diagnóstico de leishmaniose cutânea.

Para isso, foram utilizadas amostras obtidas de um animal experimental ( Mesocrisetus auratus) inoculado experimentalmente com Leishmanias.

Os autores demonstraram que a coloração Giemsa foi melhor que a coloração Pap-mart® e Gaffney. Portanto, consideraram que a coloração por Giemsa é ideal para o diagnóstico de leishmaniose cutânea.

Os excelentes resultados obtidos pelos autores devem-se ao fato de a combinação de corantes que compõem a mistura Giemsa possuir as condições necessárias para criar um contraste favorável, possibilitando distinguir claramente as estruturas dos amastigotas, tanto intra como extracelularmente.

As outras técnicas (Pap-mart® e Gaffney) também fizeram isso, mas de uma maneira mais fraca e, portanto, mais difícil de visualizar.É por isso que a coloração de Giemsa é recomendada para o diagnóstico parasitológico da leishmaniose.

Da mesma forma, um estudo de Ramírez et al (1994) avaliou a validade das manchas de Giemsa e Lendrum em esfregaços conjuntivais para a identificação de Chlamydia trachomatis.

Os autores determinaram que as colorações de Giemsa e Ledrum têm a mesma especificidade, mas Giemsa provou ser mais sensível.

Isso explica por que a coloração com Giemsa é atualmente a mais frequentemente usada para o diagnóstico de infecções por clamídia, especialmente se houver poucos recursos.

Coloração Giemsa: fundação, materiais, técnica e usos 2

Fonte: PanReac Applichem ITW Reagents. Coloração Giemsa. Versão 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Espanha.
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Recomendações para uma boa coloração

A secagem das folhas não deve ser acelerada. Você deve esperar o tempo prudente para secá-lo ao ar livre. Aproximadamente 2 horas

Cor imediatamente após 2 horas para obter melhores resultados.

Para que as manchas sejam fixadas e manchadas melhor, a amostra deve ser distribuída na folha de maneira a deixar uma camada fina e uniforme.

A amostra de sangue preferida é o capilar, pois o esfregaço é feito diretamente da gota de sangue e, portanto, a amostra não possui nenhum aditivo, o que favorece a manutenção das estruturas celulares.

No entanto, se o sangue venoso for utilizado, o EDTA deve ser usado como anticoagulante e não como heparina, uma vez que o último geralmente deforma as células.

Erros comuns na coloração de Giemsa

Na prática dessa coloração, erros podem ser cometidos. Eles são evidenciados por mudanças repentinas nas tonalidades das estruturas.

Coloração extremamente azul

Pode ser devido a:

  • Manchas muito grossas
  • Exceder o tempo de coloração
  • Lave insuficientemente.
  • Uso de reagentes bem acima do pH neutro (alcalino).

Sob essas condições, as cores das estruturas a seguir são distorcidas, de modo que os eritrócitos, em vez de morrerem de salmão rosa, ficarão verdes, os grânulos de eosinófilos que devem ser tingidos de tijolo vermelho ficarão azulados ou cinza e assim por diante. desvio nas tonalidades usuais.

Coloração excessivamente rosa

Pode ser devido a:

  • Tempo de coloração insuficiente.
  • Lavagem prolongada ou excessiva.
  • Pouco seco
  • Uso de reagentes muito ácidos.

Nesse caso específico, as estruturas que normalmente são tingidas de azul não serão quase visíveis, enquanto as estruturas que são tingidas de rosa terão tons muito exagerados.

Exemplo: os eritrócitos terão uma cor vermelha brilhante ou laranja forte, a cromatina nuclear parecerá rosa pálido e os grânulos de eosinófilos mancharão um vermelho brilhante.

Presença de precipitados no esfregaço

As causas podem ser:

  • Use lençóis sujos ou mal lavados.
  • Não deixe a mancha secar bem.
  • Deixe a solução fixadora por muito tempo.
  • Lavagem inadequada no final da coloração.
  • Filtragem inadequada ou nenhuma filtragem do corante sendo usado.

Presença de artefatos morfológicos

Nas manchas, podem aparecer artefatos morfológicos que dificultam a visualização e a interpretação das estruturas. Isto é porque:

  • Tipo de anticoagulante usado, como heparina.
  • Uso de folhas sujas, danificadas ou oleosas.

Modo de armazenamento

Após a preparação, o corante deve ser mantido à temperatura ambiente (15-25 ° C), para evitar a precipitação do corante. Deve ser armazenado em um recipiente âmbar bem fechado.

Referências

  1. Cannova D, Brito E e Simons M. Avaliação de técnicas de coloração para o diagnóstico de Leishmaniose cutânea. Salus . 2016; 20 (2): 24-29.
  2. PanReac Applichem Reagents ITW. Coloração Giemsa. Versão 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Espanha.
  3. Clark G. Staining procedures (1981), 4º. Williams & Willkins.
  4. Química Clínica Aplicada. Corante Giemsa para diagnóstico in vitro . Distribuidor: cromakit.es
  5. Ramírez I, Mejía M, García de la Riva J, Hermes F e Grazioso C. Validade das manchas de Giemsa e Lendrum em esfregaços conjuntivais para a identificação de Chlamydia trachomatis. Tigela de Sanit Panam. 1994; 116 (3): 212-216.
  6. Casas-Rincón G. Micologia Geral. 1994. 2ª Ed. Universidade Central da Venezuela, edições da Biblioteca. Venezuela, Caracas
  7. «Coloração de Giemsa.» Wikipedia, A enciclopédia livre . 1 de setembro de 2017 às 01:02 UTC. 6 de dezembro de 2018, en.wikipedia.org.

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