Enzimas de restrição: funções, tipos e exemplos

As enzimas de restrição são as endonucleases utilizados por determinados arquebactérias e bactérias para inibir ou “limitar” a propagação do vírus dentro. Eles são especialmente comuns em bactérias e fazem parte de seu sistema de defesa de DNA estranho , conhecido como sistema de restrição / modificação.

Essas enzimas catalisam o corte do DNA de fita dupla em locais específicos, de forma reproduzível e sem o uso de energia adicional. A maioria requer a presença de cofatores como magnésio ou outros cátions divalentes, embora alguns também exijam ATP ou S-adenosilmetionina.

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Esquema de reação da enzima de restrição HindIII (Fonte: Helixitta [CC BY-SA 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0)] via Wikimedia Commons)

As endonucleases de restrição foram descobertas em 1978 por Daniel Nathans, Arber Werner e Hamilton Smith, que receberam o Prêmio Nobel de Medicina por sua descoberta. Seu nome geralmente deriva do organismo onde são observados pela primeira vez.

Tais enzimas são amplamente utilizadas no desenvolvimento de métodos de clonagem de DNA e outras estratégias de biologia molecular e engenharia genética. Suas características de reconhecimento de seqüências específicas e a capacidade de cortar as seqüências próximas aos locais de reconhecimento os tornam ferramentas poderosas na experimentação genética.

Fragmentos gerados por enzimas de restrição que agiram em uma molécula de DNA específica podem ser usados ​​para recriar um “mapa” da molécula original, empregando informações nos locais onde a enzima cortou o DNA.

Algumas enzimas de restrição podem ter o mesmo local de reconhecimento no DNA, mas não necessariamente o cortam da mesma maneira. Assim, existem enzimas que fazem cortes deixando pontas cegas e enzimas que cortam deixando pontas coesivas, que têm diferentes aplicações na biologia molecular.

Atualmente, existem centenas de diferentes enzimas de restrição disponíveis comercialmente, oferecidas por diferentes estabelecimentos comerciais; Essas enzimas funcionam como tesouras moleculares “personalizadas” para diferentes fins.

Funções

As enzimas de restrição cumprem a função oposta das polimerases, uma vez que hidrolisam ou quebram a ligação éster dentro da ligação fosfodiéster entre nucleotídeos adjacentes em uma cadeia nucleotídica.

Na biologia molecular e na engenharia genética, são ferramentas amplamente utilizadas para a construção de vetores de expressão e clonagem, bem como para a identificação de sequências específicas. Eles também são úteis para a construção de genomas recombinantes e têm grande potencial biotecnológico.

Avanços recentes na terapia gênica fazem uso atual de enzimas de restrição para a introdução de genes determinados em vetores que são veículos para transportar esses genes para células vivas e que provavelmente têm a capacidade de inserir no genoma celular para realizar mudanças permanentes

Mecanismo de ação

As enzimas de restrição podem catalisar o corte do DNA de fita dupla, embora algumas sejam capazes de reconhecer sequências de DNA de fita única e até RNA . O corte ocorre após o reconhecimento das seqüências.

O mecanismo de ação consiste na hidrólise da ligação fosfodiéster entre um grupo fosfato e uma desoxirribose no esqueleto de cada cadeia de DNA. Muitas das enzimas são capazes de cortar no mesmo local que reconhecem, enquanto outras cortam entre 5 e 9 pares de bases antes ou depois.

Normalmente estas enzimas cortam na extremidade 5 ‘do grupo fosfato, resultando em fragmentos de DNA com uma extremidade fosforil 5’ e uma extremidade hidroxil terminal 3 ‘.

Como as proteínas não entram em contato direto com o local de reconhecimento no DNA, elas devem ser translocadas sucessivamente até que o local específico seja alcançado, talvez por meio de mecanismos “deslizantes” na cadeia de DNA.

Durante o corte enzimático, a ligação fosfodiéster de cada uma das cadeias de DNA é posicionada dentro de um dos locais ativos das enzimas de restrição. Quando a enzima sai do local de reconhecimento e corte, o faz através de associações transitórias não específicas.

Tipos

Atualmente, cinco tipos de enzimas de restrição são conhecidos. Aqui está uma breve descrição de cada um:

Enzimas de restrição tipo I

Essas enzimas são grandes proteínas pentaméricas com três subunidades, uma restrição, uma metilação e outra para o reconhecimento de seqüências no DNA. Essas endonucleases são proteínas multifuncionais capazes de catalisar reações de restrição e modificação, possuem atividade de ATPase e também DNA topoisomerase.

Enzimas deste tipo foram as primeiras endonucleases a serem descobertas, foram purificadas pela primeira vez na década de 1960 e, desde então, foram estudadas em grande profundidade.

As enzimas do tipo I não são amplamente utilizadas como ferramenta biotecnológica, uma vez que o local de corte pode estar a uma distância variável de até 1.000 pares de bases do local de reconhecimento, o que as torna não confiáveis ​​em termos de reprodutibilidade experimental.

Enzimas de restrição tipo II

São enzimas compostas de homodímeros ou tetrâmeros que cortam o DNA em locais definidos entre 4 e 8 pb de comprimento. Esses locais de corte são tipicamente palíndricos, ou seja, reconhecem seqüências lidas da mesma maneira nas duas direções.

Muitas das enzimas de restrição do tipo II nas bactérias cortam o DNA quando reconhecem sua natureza estranha, uma vez que não possui as modificações típicas que o próprio DNA deveria ter.

Estas são as enzimas de restrição mais simples, uma vez que não requerem outro cofator além do magnésio (Mg +) para reconhecer e cortar as seqüências de DNA.

A precisão das enzimas de restrição tipo II no reconhecimento e corte de seqüências simples no DNA em posições precisas as torna uma das mais utilizadas e indispensáveis ​​na maioria dos ramos da biologia molecular.

Dentro do grupo de enzimas de restrição do tipo II, existem várias subclasses classificadas de acordo com certas propriedades exclusivas de cada uma. A classificação dessas enzimas é feita adicionando letras do alfabeto, de A a Z, seguindo o nome da enzima.

Algumas das subclasses mais conhecidas por sua utilidade são:

Subclasse IIA

Eles são dímeros de diferentes subunidades. Eles reconhecem sequências assimétricas e são usados ​​como precursores ideais para a geração de enzimas de corte.

Subclasse IIB

Eles são compostos de mais um dímero e cortam o DNA dos dois lados da sequência de reconhecimento. Eles cortam os dois filamentos de DNA em um intervalo de pares de bases à frente do local de reconhecimento.

Subclasse CII

Enzimas deste tipo são polipeptídeos com funções de divisão e modificação de filamentos de DNA. Essas enzimas cortam os dois fios assimetricamente.

Subclasse IIE

As enzimas desta subclasse são as mais utilizadas na engenharia genética. Eles têm um sítio catalítico e geralmente requerem um efetor alostérico. Essas enzimas precisam interagir com duas cópias de sua sequência de reconhecimento para fazer um corte eficiente. Dentro desta subclasse estão as enzimas EcoRII e EcoRI.

Enzimas de restrição tipo III

As endonucleases de restrição do tipo III são compostas por apenas duas subunidades, uma é responsável pelo reconhecimento e modificação do DNA, enquanto a outra é responsável pelo corte da sequência.

Essas enzimas requerem dois cofatores para o seu funcionamento: ATP e magnésio. As enzimas de restrição desse tipo têm dois locais de reconhecimento assimétrico, translocam o DNA de maneira dependente de ATP e cortam entre 20 a 30 pb adjacentes ao local de reconhecimento.

Enzimas de restrição tipo IV

As enzimas do tipo IV são fáceis de identificar, uma vez que cortam o DNA com marcas de metilação, são compostas de várias subunidades diferentes responsáveis ​​pelo reconhecimento e pelo corte da sequência de DNA. Essas enzimas usam GTP e magnésio divalente como cofatores.

Locais de corte específicos incluem cadeias nucleotídicas com resíduos de citosina metilados ou hidroximetilados em uma ou em ambas as cadeias de ácidos nucleicos.

Enzimas de restrição tipo V

Essa classificação agrupa as enzimas do tipo CRISPER-Cas, que identificam e cortam seqüências específicas de DNA de organismos invasores. As enzimas Cas usam uma cadeia de RNA guia sintetizado pelo CRISPER para reconhecer e atacar organismos invasores.

As enzimas classificadas como tipo V são polipeptídeos estruturados por enzimas do tipo I, II e II. Eles podem cortar seções de DNA de quase qualquer organismo e com uma grande variedade de comprimentos. Sua flexibilidade e facilidade de uso fazem dessas enzimas uma das ferramentas mais usadas na engenharia genética, juntamente com as enzimas do tipo II.

Exemplos

As enzimas de restrição têm sido utilizadas para a detecção de polimorfismos de DNA, especialmente em estudos de genética populacional e estudos evolutivos usando DNA mitocondrial, a fim de obter informações sobre as taxas de substituição de nucleotídeos.

Atualmente, os vetores utilizados para a transformação de bactérias para diversos fins têm locais de multiclonagem onde são encontrados locais de reconhecimento para múltiplas enzimas de restrição.

Entre essas enzimas, as mais populares são EcoRI, II, III, IV e V, obtidas e descritas pela primeira vez em E. coli ; HindIII, de H. influenzae e BamHI de B. amyloliquefaciens.

Referências

  1. Bickle, TA e Kruger, DH (1993). Biologia da restrição de DNA. Microbiological Reviews , 57 (2), 434-450.
  2. Boyaval, P., Moineau, S., Romero, DA, & Horvath, P. (2007). CRISPR fornece resistência adquirida contra vírus em procariontes. Science , 315 (março), 1709-1713.
  3. Goodsell, D. (2002). A perspectiva molecular: Endonucleases de restrição. Células-tronco Fundamentals of Cancer Medicine , 20 , 190–191.
  4. Halford, SE (2001). Pulando, pulando e dando laços por enzimas de restrição. Transações da Sociedade Bioquímica , 29 , 363-373.
  5. Jeltsch, A. (2003). Manutenção da identidade das espécies e controle da especiação de bactérias: uma nova função para sistemas de restrição / modificação? Gene , 317 , 13-16.
  6. Krebs, J., Goldstein, E., & Kilpatrick, S. (2018). Genes XII de Lewin (12 ed.). Burlington, Massachusetts: Jones & Bartlett Learning.
  7. Li, Y., Pan, S., Zhang, Y., Ren, M., Feng, M., Peng, N., … Ela, Q. (2015). Aproveitando os sistemas CRISPR-Cas do tipo I e III para edição do genoma. Pesquisa sobre ácidos nucléicos , 1–12.
  8. Loenen, WAM, Dryden, DTF, Raleigh, EA e Wilson, GG (2013). Enzimas de restrição tipo I e seus familiares. Pesquisa sobre ácidos nucléicos , 1–25.
  9. Nathans, D. & Smith, HO (1975). Endonucleases de restrição na análise e reestruturação de moléculas de DNA. Annu Rev. Biochem. 273-293.
  10. Nei, M. & Tajima, F. (1981). Polimorfismo de DNA detectável por endonucleases de restrição. Genetics , 145-163.
  11. Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V. e Wende, W. (2005). Endonucleases de restrição celulares tipo II de ciências biológicas e moleculares: estrutura e mecanismo. CMLS Cellular and Molecular Life Sciences , 62 , 685-707.
  12. Roberts, R. (2005). Como as enzimas de restrição se tornaram os cavalos de trabalho da biologia molecular. PNAS , 102 (17), 5905-5908.
  13. Roberts, RJ e Murray, K. (1976). Endonucleases de restrição. Critical Reviews in Bioquímica , (novembro), 123-164.
  14. Stoddard, BL (2005). Estrutura e função da endonuclease homing. Revisões trimestrais de Biofísica , 1–47.
  15. Tock, MR, e Dryden, DTF (2005). A biologia da restrição e anti-restrição. Opinião Atual em Microbiologia , 8 , 466-472. https://doi.org/10.1016/j.mib.2005.06.003
  16. Wilson, GG e Murray, NE (1991). Sistemas de restrição e modificação. Annu Rev. Genet. , 25 , 585-627.
  17. Wu, Z. & Mou, K. (2016). Informações genômicas da virulência de Campylobacter jejuni e genética de populações. Infec Dis. Transl. Med. , 2 (3), 109-119.
  18. Yuan, R. (1981). Estrutura e mecanismo de endonucleases de restrição multifuncional. Annu Rev. Biochem. , 50 , 285-315.

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