Esfregaço bacteriano: características e preparação

O esfregaço bacteriano é uma extensão fina tipo película de uma suspensão de microrganismos bacterianos feita em uma placa ou lâmina de vidro transparente, para observação sob um microscópio óptico.

A extensão na forma de um filme é realizada para separar o máximo possível os microrganismos, pois, se agrupados, a observação não é clara.

Esfregaço bacteriano: características e preparação 1

Figura 1. Esfregaço bacteriano observado por microscópio eletrônico de varredura. Fonte: pixbay.com

No estudo de culturas bacterianas, técnicas de preparação, fixação e coloração são utilizadas para melhor analisá-las. Devido ao pequeno tamanho dos microrganismos, é necessário o uso de um microscópio óptico para observação.

Os microscópios ópticos são instrumentos indispensáveis ​​para a observação de manchas. Estes empregam lentes ópticas e luz, permitindo a visualização das amostras com grande aumento de tamanho.

Em geral, as células vivas não possuem estruturas principalmente coloridas, vistas ao microscópio óptico são amostras incolores e transparentes e mostram muito pouco contraste interno e com o ambiente.

A observação com o simples microscópio óptico de campo de luz, sem o uso de técnicas auxiliares de coloração, é muito limitada e é usada apenas em alguns casos, como na observação do movimento de microrganismos.

Para uma ótima observação de microrganismos, um equilíbrio entre contraste e resolução deve ser alcançado. Os detalhes das células não podem ser observados ao microscópio, mesmo com alta resolução; Os corantes são necessários por meio de técnicas de coloração, que fornecem contraste para observação.

Características de um esfregaço bacteriano de boa qualidade

Excelente contraste

Para obter um excelente contraste, existem microscópios sofisticados chamados microscópio de contraste de fase, interferência diferencial e microscópio de campo escuro . Esse tipo de microscópio é utilizado para observar estruturas bacterianas como bainhas e filamentos, entre outras.

A coloração é uma técnica simples para aumentar o contraste obtido com um microscópio de campo leve. Nesta técnica, diferentes corantes podem ser utilizados para melhorar significativamente a observação microscópica.

As manchas são feitas diretamente nas manchas ou extensões das suspensões de microrganismos nas lâminas, previamente secas e fixadas.

Bom fixo

A fixação é uma técnica usada para preservar estruturas celulares; causa inativação dos microrganismos e adesão ao vidro deslizante. Existem diferentes tratamentos de fixação: fixação por calor e fixação química.

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Ajuste de calor

Este é o método mais utilizado na observação de esfregaços bacterianos. A técnica consiste em passar a suspensão bacteriana do esfregaço através da chama de um isqueiro. Essa técnica é capaz de preservar a morfologia externa das bactérias, mas destrói suas estruturas internas.

Fixação química

A fixação química utiliza substâncias químicas na preservação, como formaldeído ou formaldeído, etanol e ácido acético, entre outras. A vantagem do uso de agentes químicos de fixação é que a preservação das estruturas celulares internas dos microrganismos é alcançada.

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Figura 2. esfregaço de sangue. Fonte: Bobjgalindo [GFDL (http://www.gnu.org/copyleft/fdl.html) ou CC BY-SA 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0)], do Wikimedia Commons

Boa coloração

Os procedimentos mais comuns para a coloração de um esfregaço previamente seco e fixo são manchas positivas ou simples, manchas diferenciais e manchas negativas. Existem também técnicas especiais para a coloração de estruturas celulares específicas (cápsula, esporos, flagelos).

Coloração positiva ou coloração simples

Coloração positiva ou simples é a técnica de coloração mais difundida. Utiliza corantes com a capacidade de se ligar a certas estruturas microbianas, permitindo que sejam observadas ao microscópio.

Esses corantes possuem grupos cromóforos (porção colorida) em sua estrutura química, com ligações duplas alternadas e ligações simples (conjugação). Esses links, por sua vez, podem estabelecer ligações iônicas ou covalentes com algumas estruturas celulares.

Os corantes utilizados na coloração positiva ou simples são principalmente derivados químicos da anilina (sais orgânicos coloridos).

Por outro lado, entre os corantes, podemos encontrar alguns com pH básico e outros com pH ácido.

Corantes básicos

Nos corantes básicos, o grupo cromóforo tem uma carga elétrica positiva. A grande maioria dos microrganismos procarióticos possui um pH interno neutro e sua superfície celular possui uma carga negativa. Através dessa interação eletrostática, o cromóforo se liga à célula e a mancha.

Exemplos de corantes básicos são azul de metileno, cristal violeta, verde malaquita, fuscina básica, safranina, entre outros.

Corantes ácidos

Nos corantes ácidos, o grupo cromóforo tem uma carga elétrica negativa. Estes são utilizados para coloração de proteínas com grupos amino carregados positivamente. Exemplos de corantes ácidos são ácido fuscina, rosa de Bengala, vermelho do Congo e eosina.

Coloração diferencial

A técnica de coloração diferencial consiste na aplicação de dois corantes de cor ou intensidade diferentes, para distinguir diferentes microorganismos ao microscópio. A coloração de Gram e a coloração rápida ácido-, manchas diferenciais são mais utilizados em bacteriologia.

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A coloração de Gram é usada como teste preliminar para conhecer a forma, tamanho, agrupamento celular, além do tipo de parede celular . Utilizando o teste de coloração de Gram, as bactérias da parede celular são classificadas em bactérias Gram-positivas e bactérias Gram-negativas.

Coloração negativa

Nesta técnica, são utilizados corantes químicos que não penetram no interior da célula, mas tornam o meio em que os microrganismos aparecem como fundo preto.

Na técnica de coloração negativa, o esfregaço é feito com uma gota de suspensão de tinta chinesa ou nigrosina, que após permitir a secagem à temperatura ambiente forma um filme opaco à passagem da luz. Dessa forma, os microorganismos são vistos como formas brilhantes em um fundo escuro.

Preparação

A. Mancha

1.- Lave as lâminas muito bem, seque com papel absorvente e identifique-as. O rótulo deve indicar o conteúdo da preparação, a data e o nome da pessoa que o processou.

2.- Acenda o isqueiro e esterilize a alça de inoculação na chama até ficar vermelho brilhante.

3.- Deixe a alça esfriar.

4.- Retire o tubo da cultura bacteriana, retire a tampa e passe rapidamente a boca do tubo perto da chama do isqueiro (chama).

5.- Insira a alça de inoculação no tubo que contém a cultura bacteriana e tire a amostra.

6.- Se a cultura estiver em meio líquido, coloque a amostra colhida com a alça no centro da lâmina e espalhe-a cuidadosamente em um círculo de aproximadamente 2 cm de diâmetro.

7.- Esterilize novamente o cabo de inoculação.

8.- Deixe secar a mancha no ar.

9.- Repita os passos 3 a 8 três vezes.

10.- Se a cultura estiver em meio sólido, uma gota de água destilada deve ser colocada previamente na lâmina. Isso é feito para misturar uma pequena amostra da cultura colhida com o cabo de inoculação, conforme indicado nas etapas 2 a 5 (condições assépticas).

11.- Espalhe a amostra diluída com a gota de água na lâmina e repita três vezes.

B. Fixação

1.- Adicione duas gotas de metanol ou etanol absoluto aos esfregaços secos derivados de culturas em meio líquido.

2.- Deixe o ar secar longe do isqueiro.

3.- Se o esfregaço provém de uma cultura em meio sólido, a fixação do esfregaço seco é realizada com calor, passando-o 2 a 3 vezes rapidamente pela área mais quente da chama mais leve.

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4.- Toque a parte inferior do esfregaço com a parte dorsal da mão esquerda (para destros; caso contrário, use a mão direita) e verifique se está frio.

C. Coloração simples

1.- Adicione 2 gotas do corante selecionado ao esfregaço e deixe o tempo necessário nos protocolos específicos de cada corante (geralmente entre 1 e 5 minutos).

2.- Alguns corantes exigem o uso de calor para sua ativação; nesse caso, você deve ter muito cuidado ao aquecer a lâmina na chama mais leve (manipule-a com uma pinça e evite ferver). Superaquecer o esfregaço pode destruir as células que você deseja observar.

3.- Remova o excesso de corante lavando com água destilada de um abeto. Remova a água de lavagem, batendo levemente na lâmina pela borda, inclinando-se sobre a mesa de trabalho.

4.- Deixe secar ao ar.

5.- Dependendo do tipo de observação, uma lamela é usada ou não nesta fase. A lamela protege e preserva a mancha. Se uma observação de imersão em óleo for feita nesse estágio, as lamelas não serão usadas, mas a mancha não poderá ser preservada.

D. Preservação final do esfregaço

1.- Mergulhe o esfregaço sucessivamente em cada uma das soluções indicadas abaixo, por no mínimo 5 minutos. O objetivo desses “banhos” é deixar o esfregaço completamente desidratado. Cada reagente deve ser drenado bem antes de introduzir o esfregaço no próximo banho.

A ordem dos banhos desidratantes é a seguinte:

  1. Etanol a 70%
  2. Etanol a 95%
  3. Acetona pura
  4. Mistura de acetona –xilol 1: 1
  5. Xilol

Em seguida, permita a secagem ao ar.

2.- Monte a lamínula, de preferência 22 × 22 mm, utilizando bálsamo canadense ou outro meio de montagem.

Referências

  1. Briggs, G. (1965). Fatores Causais em Acidentes e Infecções Laboratoriais Microbiológicas. Laboratórios Biológicos do Exército dos EUA. Fort Detrick
  2. Cappucino, JG e Welch, CT (2017). Microbiologia: Um Manual de Laboratório. Pearson
  3. Holt, JG Editor. (1977). O mais curto Manual de Bacteriologia Determinativa de Bergey. 8 th Baltimore: Williams and Wilkins Co.
  4. Johnson, TR e Case; CL (2018). Experiências de Laboratório em Microbiologia. Pearson
  5. Tille, P. (2017). Microbiologia Diagnóstica. 14 th St. Louis, EUA: Elsiever, Inc.

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