Histoquímica: fundação, processamento, coloração

O histoquímica é uma ferramenta útil no estudo da morfologia de vários tecidos biológicos (plantas e animais), devido ao seu princípio de reacção de componentes do tecido, tais como hidratos de carbono, lípidos e proteínas, entre outros, corantes químicos.

Essa ferramenta valiosa permite não apenas identificar a composição e estrutura dos tecidos e células, mas também as várias reações que ocorrem nelas. Da mesma forma, os possíveis danos teciduais, causados ​​pela presença de microrganismos ou outras patologias, podem ser evidenciados.

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Manchas histoquímicas. Vírus do Nilo, bactérias Gram-positivas e Gram-negativas (Gram), Histoplasma capsulatum (Grocott), Mycobacterium tuberculosis (Ziehl Neelsen). Fonte: Pixinio.com/Wikipedia.org/Nephron [CC BY-SA 3.0 (https://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0)[/CDC/Dr. George P. Kubica [Domínio público]

A histoquímica, desde séculos passados, forneceu contribuições importantes, como a demonstração da existência da barreira hematoencefálica por Paul Ehrlich. Isso foi possível porque o cérebro do animal experimental usado por Ehrlich não estava corado com anilina, que é um corante básico.

Isso levou ao uso de vários corantes, como os azuis de metileno e indofenol, para manchar os diferentes tipos de células. Esse achado deu origem à classificação das células em acidofílica, basofílica e neutrofílica, de acordo com sua coloração específica.

Estudos recentes aplicaram essa técnica para mostrar a presença de vários compostos, incluindo fenóis, além de carboidratos e lipídios não estruturais nos tecidos das espécies de Litsea glaucescens , mais conhecidas como louro. Encontrando-os, tanto na folha como na madeira.

Também Colares et al, 2016, identificaram a planta de interesse medicinal Tarenaya hassleriana , por meio de técnicas histoquímicas. Nesta espécie, foi evidenciada a presença de amido, mirosina e compostos fenólicos e lipofílicos.

Fundação

A histoquímica baseia-se na coloração de estruturas celulares ou moléculas presentes nos tecidos, graças à sua afinidade com corantes específicos. A reação de coloração dessas estruturas ou moléculas em seu formato original é subsequentemente visualizada no microscópio óptico ou microscópio eletrônico.

A especificidade da coloração é devida à presença de grupos aceitadores de íons presentes em células ou moléculas de tecido.

Finalmente, o objetivo das reações histoquímicas é poder mostrar através da cor. Das maiores estruturas biológicas ao menor dos tecidos e células. Isso pode ser alcançado porque os corantes reagem quimicamente com as moléculas de tecidos, células ou organelas.

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Processamento

A reação histoquímica pode envolver etapas anteriores à realização da técnica, como fixação, inclusão e corte de tecidos. Portanto, deve-se ter em mente que nessas etapas a estrutura a ser identificada pode ser danificada, produzindo resultados falso-negativos, mesmo que presentes.

Apesar disso, é importante a fixação prévia do tecido adequadamente realizado, pois evita a autólise ou a destruição celular. Para isso, são utilizadas reações químicas com solventes orgânicos, como formaldeído ou glutaraldeído, entre outros.

A inclusão do tecido é feita para manter sua firmeza quando cortada e, assim, impedir que se deforme. Finalmente, o corte é feito com um micrótomo para o estudo de amostras por microscopia óptica.

Além disso, antes de proceder à realização de manchas histoquímicas, é recomendável incorporar controles positivos externos ou internos em cada teste. Bem como o uso de corantes específicos para as estruturas a serem estudadas.

Manchas histoquímicas

Desde o surgimento das técnicas histoquímicas até o presente momento, uma ampla gama de corantes tem sido utilizada, dentre as quais as mais utilizadas são: Ácido Periódico de Schiff (PAS), Grocott, Ziehl-Neelsen e Gram.

Além disso, outros corantes têm sido utilizados com menos frequência, como tinta chinesa, orceína ou tricrômico de Masson, entre outros.

Ácido Periódico de Schiff (PAS)

Com essa coloração, você pode observar moléculas com alto teor de carboidratos, como: glicogênio e mucina. No entanto, também é útil para a identificação de microrganismos como fungos e parasitas. Além de certas estruturas (membrana basal) na pele e outros tecidos.

A base dessa coloração é que o corante oxida as ligações de carbono presentes entre dois grupos hidroxila próximos. Isso causa a liberação do grupo aldeído, e isso é detectado pelo reagente de Schiff, dando uma cor púrpura.

O reagente de Schiff é composto de fucsina básica, metabissulfito de sódio e ácido clorídrico, sendo esses componentes responsáveis ​​pela coloração púrpura, quando grupos aldeídos estão presentes. Caso contrário, um ácido incolor é gerado.

A intensidade da coloração dependerá da quantidade de grupos hidroxila presentes nos monossacarídeos. Por exemplo, em fungos, membranas basais, mucinas e glicogênio, a cor pode variar de vermelho a roxo, enquanto os núcleos ficam azuis.

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Grocott

É uma das manchas que apresenta maior sensibilidade na identificação de fungos nos tecidos incluídos na parafina. Isso permite a identificação das várias estruturas fúngicas: hifas , esporos, endosporos, entre outras. Portanto, é considerada uma mancha de rotina para o diagnóstico de micose.

É especialmente utilizado no diagnóstico de micoses pulmonares, como pneumocistose e aspergilose, causadas por alguns fungos dos gêneros Pneumocystis e Aspergillus, respectivamente.

Esta solução contém nitrato de prata e ácido crômico, sendo este último fixador e corante. A lógica é que esse ácido produz a oxidação de grupos hidroxila em aldeídos, pelos mucopolissacarídeos presentes nas estruturas fúngicas, por exemplo, na parede celular dos fungos.

Finalmente, a prata presente na solução é oxidada pelos aldeídos, causando uma coloração negra, que é denominada reação argentafin. Corantes de contraste, como verde claro, também podem ser usados ​​para que sejam observadas estruturas fúngicas em preto com fundo verde claro.

Ziehl-Neelsen

Essa coloração é baseada na presença de resistência ao álcool ácido, parcial ou totalmente, em alguns microorganismos como os gêneros Nocardia , Legionella e Mycobacterium.

Recomenda-se o uso dessa coloração, porque a parede celular dos microrganismos mencionados anteriormente contém lipídios complexos que dificultam a penetração dos corantes. Especialmente em amostras do trato respiratório.

Utiliza corantes fortes, como a fucsina fenólica (corante básico), e o calor é aplicado para que o microorganismo possa reter o corante e não descolorir com ácidos e álcoois. Finalmente, uma solução de azul de metileno é aplicada para colorir as estruturas que descoloriram.

A presença de resistência ácido-álcool é observada nas estruturas tingidas de vermelho, enquanto as estruturas que não resistem ao desbotamento são tingidas de azul.

Grama e tinta chinesa

Gram é uma coloração muito útil no diagnóstico de infecções bacterianas e fúngicas, entre outras. Essa coloração permite diferenciar microrganismos Gram-positivos e Gram-negativos, evidenciando claramente as diferenças existentes na composição da parede celular.

Enquanto a tinta chinesa é uma mancha usada para contrastar estruturas contendo polissacarídeos (cápsula). Isso ocorre porque um anel é formado no ambiente, sendo possível no Cryptococcus neoformans .

Orcein

Com essa coloração, as fibras elásticas e os cromossomos de várias células são coloridos, permitindo a avaliação do processo de maturação das últimas. Por esse motivo, tem sido muito útil em estudos citogenéticos.

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Isso se baseia na captação do corante pela carga negativa de moléculas como o DNA, presentes nos núcleos da grande variedade de células. Portanto, estes são tingidos de azul a violeta escuro.

Tricromo de Masson

Essa coloração é usada na identificação de alguns microorganismos ou materiais que contêm pigmentos de melanina. É o caso das micoses, causadas por fungos dematiáceos, feohifomicose e eumicetoma de grão preto.

Considerações finais

Nos últimos anos, houve muitos avanços na criação de novas técnicas de diagnóstico, nas quais a histoquímica está envolvida, mas ligada a outros fundamentos ou princípios. Essas técnicas têm uma finalidade diferente, como é o caso da imuno-histoquímica ou da enzima-histoquímica.

Referências

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