Histoquímica: fundação, processamento, coloração

A histoquímica é uma técnica utilizada em biologia e medicina para estudar a localização e distribuição de substâncias químicas em tecidos biológicos. Esta técnica é fundamental para compreender a fisiologia e patologia dos tecidos, permitindo a identificação de moléculas específicas, como proteínas, lipídios e carboidratos, em nível celular e subcelular. O processo histoquímico envolve a fixação dos tecidos, processamento para a inclusão em parafina, corte em lâminas finas, coloração com reagentes específicos e observação ao microscópio. A combinação de diferentes corantes permite a visualização e diferenciação de diversas estruturas e moléculas, fornecendo informações valiosas para a pesquisa científica e diagnóstico clínico.

Três fases do processamento histológico: Desidratação, Clareamento e Infiltração.

A histoquímica é uma técnica utilizada para estudar a distribuição de substâncias químicas nos tecidos biológicos, permitindo a visualização de moléculas específicas e a compreensão de processos biológicos. O processamento histológico é uma etapa fundamental nesse tipo de análise, envolvendo várias etapas, como a desidratação, clareamento e infiltração.

A desidratação é o primeiro passo do processamento histológico, no qual o tecido é gradualmente exposto a solventes orgânicos, como álcool, para remover a água e preparar o tecido para a próxima etapa. Esse processo é importante para evitar danos nas estruturas celulares e garantir a preservação adequada do material para as análises subsequentes.

O clareamento é a etapa seguinte, na qual o tecido desidratado é exposto a substâncias químicas, como xilol, para remover os solventes utilizados na desidratação e tornar o tecido transparente. Esse processo facilita a visualização das estruturas celulares durante a coloração e a análise microscópica, permitindo uma melhor interpretação dos resultados obtidos.

A infiltração é a última fase do processamento histológico, na qual o tecido é impregnado com uma substância de inclusão, como parafina derretida, para garantir a rigidez necessária para o corte em lâminas finas. Essa etapa é fundamental para a obtenção de cortes histológicos precisos e apropriados para a realização de técnicas de coloração e análise histoquímica.

Coloração mais comum em preparo histológico permanente: Qual é a mais utilizada?

A coloração mais comum em preparo histológico permanente é a coloração de hematoxilina e eosina (H&E). Essa técnica é amplamente utilizada em laboratórios de histologia devido à sua capacidade de corar diferentes estruturas celulares e teciduais de forma distinta.

A coloração de H&E consiste em corar o núcleo das células em azul (hematoxilina) e o citoplasma em rosa (eosina). Essa combinação de cores permite uma melhor visualização e identificação das diferentes estruturas presentes nos tecidos examinados.

Além da coloração de H&E, existem outras técnicas de coloração utilizadas em histologia, como a coloração de tricrômico de Masson e a coloração de PAS (ácido periódico de Schiff). Cada uma dessas técnicas tem suas próprias aplicações e são utilizadas de acordo com o tipo de tecido e as estruturas que se deseja estudar.

Essa técnica é essencial para o estudo microscópico dos tecidos e desempenha um papel fundamental na área da histologia.

Qual a ordem correta para realizar a técnica histológica em laboratório?

A histoquímica é uma técnica utilizada em laboratórios de histologia para identificar substâncias químicas nos tecidos biológicos. Para realizar essa técnica corretamente, é importante seguir uma ordem específica de processamento e coloração.

O primeiro passo é a fixação do tecido, que impede a deterioração e preserva a estrutura celular. Em seguida, o tecido é desidratado para remoção da água, e embebido em um meio de inclusão para facilitar o corte em lâminas finas.

Após a inclusão, o tecido é congelado ou parafinado para facilitar o corte. Em seguida, as lâminas são preparadas e coradas com substâncias específicas para identificar as moléculas de interesse.

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Por fim, as lâminas são montadas e observadas ao microscópio para análise dos resultados. Seguindo esses passos, é possível realizar a técnica de histoquímica de forma eficiente e obter informações precisas sobre os tecidos biológicos.

A importância da coloração nos cortes histológicos para uma análise precisa.

A histologia é uma área da biologia que estuda os tecidos biológicos em nível microscópico, utilizando técnicas de processamento e coloração para permitir a visualização das estruturas celulares e extracelulares. A coloração é um passo crucial no processo de preparação de cortes histológicos, pois ela destaca as diferentes estruturas e componentes dos tecidos, facilitando a análise e interpretação dos resultados.

As cores resultantes da coloração permitem a identificação de características específicas das células e tecidos, como a presença de proteínas, lipídios, carboidratos, ácidos nucleicos e outras substâncias. Isso é essencial para a identificação de patologias, avaliação de processos biológicos e pesquisa científica.

Além disso, a coloração adequada dos cortes histológicos ajuda a distinguir entre os diferentes tipos de tecidos presentes em uma amostra, como músculo, tecido nervoso, tecido epitelial, entre outros. Isso é fundamental para uma análise precisa e confiável, evitando interpretações equivocadas.

Histoquímica: fundação, processamento, coloração

O histoquímica é uma ferramenta útil no estudo da morfologia de vários tecidos biológicos (plantas e animais), devido ao seu princípio de reacção de componentes do tecido, tais como hidratos de carbono, lípidos e proteínas, entre outros, corantes químicos.

Essa ferramenta valiosa permite não apenas identificar a composição e estrutura dos tecidos e células, mas também as várias reações que ocorrem nelas. Da mesma forma, os possíveis danos teciduais, causados ​​pela presença de microrganismos ou outras patologias, podem ser evidenciados.

Histoquímica: fundação, processamento, coloração 1

Manchas histoquímicas. Vírus do Nilo, bactérias Gram-positivas e Gram-negativas (Gram), Histoplasma capsulatum (Grocott), Mycobacterium tuberculosis (Ziehl Neelsen). Fonte: Pixinio.com/Wikipedia.org/Nephron [CC BY-SA 3.0 (https://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0)[/CDC/Dr. George P. Kubica [Domínio público]

A histoquímica, desde séculos passados, forneceu contribuições importantes, como a demonstração da existência da barreira hematoencefálica por Paul Ehrlich. Isso foi possível porque o cérebro do animal experimental usado por Ehrlich não estava corado com anilina, que é um corante básico.

Isso levou ao uso de vários corantes, como os azuis de metileno e indofenol, para manchar os diferentes tipos de células. Esse achado deu origem à classificação das células em acidofílica, basofílica e neutrofílica, de acordo com sua coloração específica.

Estudos recentes aplicaram essa técnica para mostrar a presença de vários compostos, incluindo fenóis, além de carboidratos e lipídios não estruturais nos tecidos das espécies de Litsea glaucescens , mais conhecidas como louro. Encontrando-os, tanto na folha como na madeira.

Também Colares et al, 2016, identificaram a planta de interesse medicinal Tarenaya hassleriana , por meio de técnicas histoquímicas. Nesta espécie, foi evidenciada a presença de amido, mirosina e compostos fenólicos e lipofílicos.

Fundação

A histoquímica baseia-se na coloração de estruturas celulares ou moléculas presentes nos tecidos, graças à sua afinidade com corantes específicos. A reação de coloração dessas estruturas ou moléculas em seu formato original é subsequentemente visualizada no microscópio óptico ou microscópio eletrônico.

A especificidade da coloração é devida à presença de grupos aceitadores de íons presentes em células ou moléculas de tecido.

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Finalmente, o objetivo das reações histoquímicas é poder mostrar através da cor. Das maiores estruturas biológicas ao menor dos tecidos e células. Isso pode ser alcançado porque os corantes reagem quimicamente com as moléculas de tecidos, células ou organelas.

Processamento

A reação histoquímica pode envolver etapas anteriores à realização da técnica, como fixação, inclusão e corte de tecidos. Portanto, deve-se ter em mente que nessas etapas a estrutura a ser identificada pode ser danificada, produzindo resultados falso-negativos, mesmo que presentes.

Apesar disso, é importante a fixação prévia do tecido adequadamente realizado, pois evita a autólise ou a destruição celular. Para isso, são utilizadas reações químicas com solventes orgânicos, como formaldeído ou glutaraldeído, entre outros.

A inclusão do tecido é feita para manter sua firmeza quando cortada e, assim, impedir que se deforme. Finalmente, o corte é feito com um micrótomo para o estudo de amostras por microscopia óptica.

Além disso, antes de proceder à realização de manchas histoquímicas, é recomendável incorporar controles positivos externos ou internos em cada teste. Bem como o uso de corantes específicos para as estruturas a serem estudadas.

Manchas histoquímicas

Desde o surgimento das técnicas histoquímicas até o presente momento, uma ampla gama de corantes tem sido utilizada, dentre as quais as mais utilizadas são: Ácido Periódico de Schiff (PAS), Grocott, Ziehl-Neelsen e Gram.

Além disso, outros corantes têm sido utilizados com menos frequência, como tinta chinesa, orceína ou tricrômico de Masson, entre outros.

Ácido Periódico de Schiff (PAS)

Com essa coloração, você pode observar moléculas com alto teor de carboidratos, como: glicogênio e mucina. No entanto, também é útil para a identificação de microrganismos como fungos e parasitas. Além de certas estruturas (membrana basal) na pele e outros tecidos.

A base dessa coloração é que o corante oxida as ligações de carbono presentes entre dois grupos hidroxila próximos. Isso causa a liberação do grupo aldeído, e isso é detectado pelo reagente de Schiff, dando uma cor púrpura.

O reagente de Schiff é composto de fucsina básica, metabissulfito de sódio e ácido clorídrico, sendo esses componentes responsáveis ​​pela coloração púrpura, quando grupos aldeídos estão presentes. Caso contrário, um ácido incolor é gerado.

A intensidade da coloração dependerá da quantidade de grupos hidroxila presentes nos monossacarídeos. Por exemplo, em fungos, membranas basais, mucinas e glicogênio, a cor pode variar de vermelho a roxo, enquanto os núcleos ficam azuis.

Grocott

É uma das manchas que apresenta maior sensibilidade na identificação de fungos nos tecidos incluídos na parafina. Isso permite a identificação das várias estruturas fúngicas: hifas , esporos, endosporos, entre outras. Portanto, é considerada uma mancha de rotina para o diagnóstico de micose.

É especialmente utilizado no diagnóstico de micoses pulmonares, como pneumocistose e aspergilose, causadas por alguns fungos dos gêneros Pneumocystis e Aspergillus, respectivamente.

Esta solução contém nitrato de prata e ácido crômico, sendo este último fixador e corante. A lógica é que esse ácido produz a oxidação de grupos hidroxila em aldeídos, pelos mucopolissacarídeos presentes nas estruturas fúngicas, por exemplo, na parede celular dos fungos.

Finalmente, a prata presente na solução é oxidada pelos aldeídos, causando uma coloração negra, que é denominada reação argentafin. Corantes de contraste, como verde claro, também podem ser usados ​​para que sejam observadas estruturas fúngicas em preto com fundo verde claro.

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Ziehl-Neelsen

Essa coloração é baseada na presença de resistência ao álcool ácido, parcial ou totalmente, em alguns microorganismos como os gêneros Nocardia , Legionella e Mycobacterium.

Recomenda-se o uso dessa coloração, porque a parede celular dos microrganismos mencionados anteriormente contém lipídios complexos que dificultam a penetração dos corantes. Especialmente em amostras do trato respiratório.

Utiliza corantes fortes, como a fucsina fenólica (corante básico), e o calor é aplicado para que o microorganismo possa reter o corante e não descolorir com ácidos e álcoois. Finalmente, uma solução de azul de metileno é aplicada para colorir as estruturas que descoloriram.

A presença de resistência ácido-álcool é observada nas estruturas tingidas de vermelho, enquanto as estruturas que não resistem ao desbotamento são tingidas de azul.

Grama e tinta chinesa

Gram é uma coloração muito útil no diagnóstico de infecções bacterianas e fúngicas, entre outras. Essa coloração permite diferenciar microrganismos Gram-positivos e Gram-negativos, evidenciando claramente as diferenças existentes na composição da parede celular.

Enquanto a tinta chinesa é uma mancha usada para contrastar estruturas contendo polissacarídeos (cápsula). Isso ocorre porque um anel é formado no ambiente, sendo possível no Cryptococcus neoformans .

Orcein

Com essa coloração, as fibras elásticas e os cromossomos de várias células são coloridos, permitindo a avaliação do processo de maturação das últimas. Por esse motivo, tem sido muito útil em estudos citogenéticos.

Isso se baseia na captação do corante pela carga negativa de moléculas como o DNA, presentes nos núcleos da grande variedade de células. Portanto, estes são tingidos de azul a violeta escuro.

Tricromo de Masson

Essa coloração é usada na identificação de alguns microorganismos ou materiais que contêm pigmentos de melanina. É o caso das micoses, causadas por fungos dematiáceos, feohifomicose e eumicetoma de grão preto.

Considerações finais

Nos últimos anos, houve muitos avanços na criação de novas técnicas de diagnóstico, nas quais a histoquímica está envolvida, mas ligada a outros fundamentos ou princípios. Essas técnicas têm uma finalidade diferente, como é o caso da imuno-histoquímica ou da enzima-histoquímica.

Referências

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