Imunofluorescência: justificativa, protocolo e aplicações

A imunofluorescência é uma técnica poderosa imunocoloração utilizando anticorpos ligados covalentemente a moléculas fluorescentes para identificar alvos específicos em amostras de células fixadas sobre um suporte sólido.

Esta técnica observação microscópica com especificidade imunológica, possibilitando observar células vivas ou mortas que podem apresentar pequenas quantidades de antígenos. É amplamente utilizado no campo da pesquisa e no diagnóstico clínico de várias patologias.

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Imunomarcação de filamentos de actina em células de cardiomiócitos (Fonte: Ps1415 [CC BY-SA 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0)] via Wikimedia Commons)

Essa técnica, principalmente qualitativa (com algumas variantes quantitativas), tem a ver especificamente com a visualização de uma amostra pelo sinal produzido por um fluoróforo, que é uma molécula fluorescente ligada a um anticorpo e capaz de ser excitada em um determinado comprimento de onda .

No contexto celular, é muito útil estudar a presença / ausência e localização subcelular de proteínas. A técnica foi inicialmente usada no cenário clínico para o diagnóstico de vírus como influenza e, posteriormente, para muitas outras doenças infecciosas.

É uma técnica de grande sensibilidade e, com o equipamento de microscopia apropriado, você pode ter uma resolução muito boa. Requer, para observação, o uso de microscópios confocais ou de epifluorescência.

No entanto, apesar de muito popular, pode apresentar alguns problemas importantes em relação à obtenção de fluorescência inespecífica que gera um certo “ruído” de fundo, o que geralmente limita a leitura adequada dos resultados.

Fundação

A imunofluorescência é baseada na exploração do fenômeno biológico da reação de interação entre um anticorpo e um antígeno. Tem a ver especificamente com a visualização ou detecção dessa reação, estimulando as moléculas fluorescentes a um comprimento de onda específico.

Um anticorpo é uma proteína de imunoglobulina secretada a partir de células B ativas e gerada especificamente contra um antígeno, ao qual pode se ligar com grande afinidade e especificidade. A imunofluorescência utiliza imunoglobulinas IgG, que são solúveis no soro sanguíneo.

Os anticorpos são moléculas de até 950 kDa compostas por duas cadeias peptídicas “Y” (pesadas) curtas (leves) e longas. As cadeias leve e pesada são divididas em dois domínios: uma variável capaz de reconhecer o antígeno e outra constante ou conservada, característica de cada espécie.

Os antígenos são funcionalmente definidos como moléculas que podem ser reconhecidas por um anticorpo e são principalmente proteínas. Quando um animal é exposto a um antígeno, os linfócitos do sistema imunológico são ativados, produzindo anticorpos específicos contra ele e que funcionam como um sistema de defesa.

Um antígeno, como uma proteína, por exemplo, pode ter mais de um epítopo ou local de reconhecimento para um anticorpo, pelo que o soro do animal exposto a um antígeno pode ter anticorpos policlonais contra diferentes regiões da mesma proteína.

A imunofluorescência, então, explora a capacidade de um animal produzir anticorpos policlonais contra um antígeno específico para purificá-lo e subsequentemente usá-lo para a detecção do mesmo antígeno em outros contextos.

Entre os corantes ou moléculas fluorescentes mais usados ​​para algumas técnicas de imunofluorescência estão o isotiocianato de fluoresceína (FITC), isotiocianato de tetrametilrodamina-5 e 6 (TRITC), muitas cianinas como Cy2, Cy3, Cy5 e Cy7 e corantes chamados Alexa Fluor® , como o Alexa Fluor®448.

Protocolo

O protocolo de imunofluorescência varia dependendo de muitos fatores, no entanto, e em geral, abrange uma sequência linear de etapas que consiste em:

  • Preparação de folhas e células
  • Fixação da amostra
  • Permeabilização
  • Bloquear
  • Imunocoloração ou imunomarcação
  • Montagem e observação

-Preparação

Das amostras

A preparação da amostra dependerá de sua natureza e do tipo de experiência a ser realizada. A seguir, será explicado o caso mais simples, que envolve o uso de células em suspensão.

As células em suspensão, isto é, em um meio de cultura líquido, devem primeiro ser separadas por centrifugação e depois devem ser lavadas com um tampão isosmótico ou tampão que preserva sua integridade.

Normalmente, é utilizado um tampão fosfato-salino conhecido como PBS, no qual as células são ressuspensas e essa mistura é centrifugada novamente para obter as células livres do meio de cultura, que pode ter substâncias interferentes.

Dos lençóis

As folhas usadas para observação microscópica, onde as células serão posteriormente fixadas para os tratamentos a jusante correspondentes, também devem ser cuidadosamente preparadas.

Estes são cobertos ou “sensibilizados” com uma solução de polilisina, um polímero sintético que atuará como uma “cola molecular” entre as células e o suporte sólido, graças à interação eletrostática entre as cargas positivas de seus grupos amino e cargas negativas das proteínas que revestem as células.

Fixação da amostra

Esse processo consiste em imobilizar as proteínas encontradas no interior da célula para manter intacta sua localização espacial. As moléculas utilizadas devem ser capazes de passar por todos os tipos de membranas celulares e formar estruturas com proteínas covalentes.

Formaldeído e paraformaldeído, glutaraldeído e até metanol são amplamente utilizados, com os quais as amostras de células são incubadas por um certo tempo e depois lavadas com uma solução tampão isosmótica.

Após a fixação das células, elas continuam a ser anexadas às folhas previamente sensibilizadas com poli-lisina.

Permeabilização

Dependendo do tipo de teste realizado, será necessário permeabilizar ou não as células em estudo. Se o que se busca é conhecer a localização, presença ou ausência de uma determinada proteína na superfície celular, a permeabilização não será necessária.

Por outro lado, se você quiser saber a localização de uma proteína dentro da célula, a permeabilização é essencial e consistirá na incubação das amostras com Triton X-100, um detergente capaz de permeabilizar as membranas celulares.

Bloquear

Um passo fundamental em todas as técnicas imunológicas é o bloqueio. Nesta fase do procedimento, o bloqueio consiste em cobrir, nas folhas sensibilizadas, todos os locais com moléculas de poli-lisina às quais nenhuma célula aderiu. Ou seja, impede qualquer união inespecífica.

Normalmente para o bloqueio, são utilizadas soluções com albumina de soro bovino (BSA) em tampão PBS e os melhores resultados são obtidos quanto maior o tempo de incubação com esta solução. Após cada etapa, incluindo o bloqueio, a solução restante deve ser removida por lavagem.

Imunocoloração ou imunomarcação

O procedimento de imunocoloração ou imunocoloração dependerá principalmente se for uma imunofluorescência direta ou indireta (veja abaixo).

Se for uma imunofluorescência primária ou direta, as amostras serão incubadas com os anticorpos desejados, que devem ser acoplados aos corantes fluorescentes. O procedimento de incubação consiste em diluir o anticorpo em uma solução que também conterá BSA, mas em uma proporção menor.

Quando o caso é de uma imunofluorescência secundária ou indireta, duas incubações consecutivas devem ser realizadas. Primeiro com os anticorpos desejados e depois com os anticorpos capazes de detectar as regiões constantes das imunoglobulinas primárias. São esses anticorpos secundários que estão covalentemente ligados aos fluoróforos.

A técnica é muito versátil, permitindo a marcação simultânea de mais de um antígeno por amostra, desde que haja anticorpos primários acoplados a diferentes fluoróforos, no caso de imunofluorescência direta.

Para marcações simultâneas na imunofluorescência indireta, é necessário garantir que cada anticorpo primário seja produzido em um animal diferente, bem como que cada anticorpo secundário seja acoplado a um fluoróforo diferente.

Como o bloqueio, a incubação com os anticorpos fornece melhores resultados quanto mais tempo for. Após cada etapa, é necessário lavar o excesso de anticorpos que não se ligaram às amostras e, na imunofluorescência secundária, é necessário bloquear antes de adicionar o anticorpo secundário.

Certas técnicas usam outros corantes que não têm relação com a imunomarcação, como a coloração do DNA nuclear com fluoróforo DAPI.

Montagem e observação

Durante o tempo final de incubação com fluoróforos, é necessário que as amostras permaneçam no escuro. Para observação microscópica, é comum o uso de algumas substâncias para preservação da fluorescência de fluoróforos acoplados a anticorpos.

Tipos

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Resumo gráfico da imunofluorescência direta e indireta (Fonte: Westhayl618 [CC BY-SA 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0)] via Wikimedia Commons)

Imunofluorescência direta ou primária

Tem a ver com a detecção de antígenos através do uso de anticorpos fluorescentes. A principal vantagem do uso dessa técnica é sua velocidade, no entanto, muitos casos de ligação inespecífica podem ocorrer no processo, principalmente no estudo de soros humanos, pois são ricos em anticorpos muito heterogêneos.

Imunofluorescência indireta ou secundária

Também é conhecida como técnica “sanduíche” e isso envolve o desenvolvimento da técnica em duas etapas. O primeiro tem a ver com o uso de um anticorpo não fluorescente e sua ligação ao antígeno de interesse.

Contra a região constante deste primeiro anticorpo (que agora servirá como antígeno), é utilizado um segundo anticorpo capaz de reconhecê-lo, associado a uma molécula fluorescente.

A aparência de um sinal fluorescente será o resultado de um reconhecimento específico entre o primeiro anticorpo não fluorescente e o antígeno de interesse; a presença desse primeiro anticorpo determina a do segundo, que é marcado e graças à qual a presença ou ausência do antígeno pode ser determinada.

Apesar de ser uma técnica que consome muito mais tempo do que a imunofluorescência direta (inclui mais uma etapa de incubação), essa técnica não envolve o design de um anticorpo fluorescente para cada antígeno estudado, o que resulta em termos econômicos, mais viável

Além disso, é uma técnica mais sensível em termos de amplificação de sinal, uma vez que mais de um anticorpo secundário pode se ligar à região constante do anticorpo primário, amplificando a intensidade do sinal fluorescente.

Aplicações

Como pode ser observado anteriormente, a imunofluorescência é uma técnica extremamente versátil, que tem recebido vários usos nos campos científico e clínico. Pode ser usado para responder a perguntas ecológicas, genéticas e fisiológicas relacionadas a muitos organismos.

Dentre as aplicações clínicas, é utilizado para o diagnóstico direto de algumas doenças dermatológicas, seja por imunofluorescência direta ou indireta no tecido epitelial dos pacientes estudados.

Técnicas de imunofluorescência em organismos unicelulares, como leveduras, estão disponíveis para visualizar microtúbulos intranucleares e citoplasmáticos, actina e proteínas associadas, filamentos de 10 nm e outros constituintes do citoplasma , membrana e paredes celulares.

Referências

  1. Abcam, imunocitoquímica e protocolo de imunofluorescência. Obtido em abcam.com
  2. Greph, C. (2012). Corantes fluorescentes. Obtido em leica-microsystems.com
  3. Miller, DM, e Shakest, DC (1995). Microscopia de imunofluorescência. In Methods in Cell Biology (Vol. 48, pp. 365-394). Academic Press, Inc.
  4. Odell, ID, & Cook, D. (2013). Técnicas de imunofluorescência. Jornal de Dermatologia Investigativa , 133 , 1–4.
  5. Princle, BJR, Adams, AEM, Druain, DG e Brian, K. (1991). Métodos de imunofluorescência para leveduras. In Methods of Enzymology (Vol. 194, pp. 565-602). Academic Press, Inc.
  6. Schaeffer, M., Orsi, E.V. e Widelock, D. (1964). Aplicações da imunofluorescência em virologia em saúde pública. Bacteriological Reviews , 28 (4), 402-408.
  7. Vrieling, EG; e Anderson, DM (1996). Imunofluorescência na pesquisa fitoplanctônica: aplicações e potencial. J: Phycol. , 32 , 1-16.

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