Imunofluorescência: justificativa, protocolo e aplicações

A imunofluorescência é uma técnica amplamente utilizada em biologia e medicina para identificar e localizar moléculas específicas em amostras biológicas. A justificativa para o uso dessa técnica está na sua alta sensibilidade e especificidade, que permitem a detecção de proteínas, antígenos e anticorpos em níveis muito baixos. O protocolo da imunofluorescência consiste na incubação da amostra com um anticorpo primário específico, seguido da adição de um anticorpo secundário marcado com fluoróforo. Após a lavagem da amostra, a detecção das moléculas alvo é feita através da emissão de luz fluorescente sob um microscópio. As aplicações da imunofluorescência são diversas, sendo utilizada em estudos de biologia celular, diagnóstico de doenças, pesquisa em biomedicina, entre outras áreas. Essa técnica é fundamental para o entendimento de processos celulares e moleculares, contribuindo para avanços significativos na área da saúde.

Qual a finalidade da técnica de imunofluorescência e como ela é utilizada na prática?

A técnica de imunofluorescência é amplamente utilizada em diversas áreas da pesquisa biológica e médica. Sua principal finalidade é detectar e visualizar a presença de antígenos específicos em células ou tecidos, utilizando anticorpos marcados com fluoróforos. Essa técnica é extremamente sensível e permite a identificação de proteínas, vírus, bactérias e outros componentes biológicos em amostras biológicas.

Na prática, a imunofluorescência é realizada através de uma série de etapas. Primeiramente, a amostra é fixada e permeabilizada para permitir a entrada dos anticorpos. Em seguida, os anticorpos primários são incubados com a amostra, seguidos pelos anticorpos secundários marcados com fluoróforos. Após a lavagem para remover anticorpos não ligados, a amostra é observada em um microscópio de fluorescência, onde a presença dos antígenos é detectada pela emissão de luz fluorescente.

A imunofluorescência tem diversas aplicações práticas, sendo amplamente utilizada em diagnóstico clínico, pesquisa científica e biotecnologia. Por exemplo, na área da saúde, ela é utilizada para detectar a presença de vírus, bactérias e proteínas tumorais em amostras de pacientes. Na pesquisa científica, a técnica é empregada para estudar a localização e a expressão de proteínas em células e tecidos, contribuindo para o avanço do conhecimento científico.

Em resumo, a imunofluorescência é uma técnica poderosa e versátil que desempenha um papel fundamental em diversas áreas da biologia e medicina. Sua capacidade de detectar e visualizar antígenos específicos torna-a uma ferramenta essencial para o estudo e diagnóstico de diversas doenças e processos biológicos.

Passo a passo do exame de imunofluorescência: saiba como é realizado o procedimento.

A imunofluorescência é uma técnica utilizada para identificar e quantificar a presença de anticorpos ou antígenos em uma amostra biológica. Este exame é amplamente utilizado na área da saúde para diagnóstico de diversas doenças, como autoimunes, infecciosas e neoplásicas.

O procedimento de imunofluorescência envolve várias etapas, que devem ser seguidas cuidadosamente para garantir resultados precisos. Abaixo, descrevemos o passo a passo do exame:

1. Preparação da amostra: A amostra biológica a ser analisada é coletada e preparada de acordo com o tipo de exame a ser realizado. Em seguida, é aplicado um reagente de imunofluorescência específico para a detecção do antígeno de interesse.

2. Incubação: A amostra é incubada em condições específicas, geralmente em uma câmara úmida e escura, para permitir a interação entre o anticorpo marcado e o antígeno presente na amostra.

3. Lavagem: Após a incubação, a amostra é lavada para remover o excesso de reagente e reduzir possíveis interferências no resultado final.

4. Observação ao microscópio: A amostra é analisada em um microscópio de fluorescência, que permite a visualização e a identificação das fluorescências emitidas pelo complexo anticorpo-antígeno.

5. Interpretação dos resultados: Os padrões de fluorescência observados são interpretados por um profissional capacitado, que irá avaliar a presença, intensidade e distribuição do antígeno ou anticorpo na amostra.

A imunofluorescência é uma técnica sensível e específica, que possui diversas aplicações na área da saúde, como no diagnóstico de doenças autoimunes, detecção de agentes infecciosos e monitoramento de tratamentos. Por isso, é importante seguir corretamente o protocolo do exame para garantir resultados confiáveis e precisos.

Aplicações da técnica de imunofluorescência indireta na identificação de antígenos e anticorpos.

Uma das aplicações da técnica de imunofluorescência indireta na identificação de antígenos e anticorpos é a sua utilização na pesquisa e diagnóstico de doenças autoimunes. Através da marcação de anticorpos específicos com fluoróforos, é possível visualizar a presença de autoanticorpos em amostras de pacientes, auxiliando no diagnóstico e monitoramento de doenças como lúpus eritematoso sistêmico e artrite reumatoide.

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Além disso, a imunofluorescência indireta também é amplamente utilizada em estudos de microbiologia, permitindo a identificação de antígenos de microrganismos em amostras clínicas. A técnica é especialmente útil na detecção de infecções virais, bacterianas e fúngicas, contribuindo para o diagnóstico preciso e rápido de patologias infecciosas.

Outra aplicação importante da imunofluorescência indireta é na pesquisa científica, onde é empregada para a identificação e caracterização de proteínas em diversos tipos de amostras biológicas. A técnica permite a visualização direta de antígenos específicos em células e tecidos, facilitando a investigação de processos biológicos e a compreensão de mecanismos moleculares.

Em resumo, a imunofluorescência indireta é uma ferramenta poderosa e versátil na identificação de antígenos e anticorpos, com aplicações que vão desde o diagnóstico de doenças até a pesquisa científica. A sua sensibilidade e especificidade tornam-na uma técnica indispensável em diversos campos da biomedicina.

Indicações para solicitar exame de imunofluorescência em diferentes situações clínicas.

Indicações para solicitar exame de imunofluorescência em diferentes situações clínicas podem variar de acordo com a suspeita diagnóstica do paciente. Este exame é utilizado principalmente para identificar a presença de anticorpos específicos no organismo, auxiliando no diagnóstico de diversas doenças autoimunes e infecciosas.

Em casos de suspeita de lúpus eritematoso sistêmico, por exemplo, a imunofluorescência pode ser solicitada para detectar a presença de anticorpos antinucleares (ANA) no soro do paciente. Já em situações de suspeita de dermatite herpetiforme, a imunofluorescência pode ser utilizada para identificar a presença de anticorpos IgA no tecido da pele.

Além disso, em pacientes com suspeita de vasculites, a imunofluorescência pode ser solicitada para detectar a presença de depósitos de imunoglobulinas e complemento nos vasos sanguíneos. Em casos de infecções virais, como a hepatite B, a imunofluorescência pode ser útil para identificar a presença do antígeno HBsAg no fígado.

Em resumo, a imunofluorescência é um exame importante que pode ser solicitado em diversas situações clínicas para auxiliar no diagnóstico de doenças autoimunes, infecciosas e inflamatórias. É importante ressaltar que a interpretação dos resultados deve ser feita por um profissional capacitado, levando em consideração o quadro clínico do paciente.

Imunofluorescência: justificativa, protocolo e aplicações

A imunofluorescência é uma técnica poderosa imunocoloração utilizando anticorpos ligados covalentemente a moléculas fluorescentes para identificar alvos específicos em amostras de células fixadas sobre um suporte sólido.

Esta técnica observação microscópica com especificidade imunológica, possibilitando observar células vivas ou mortas que podem apresentar pequenas quantidades de antígenos. É amplamente utilizado no campo da pesquisa e no diagnóstico clínico de várias patologias.

Imunofluorescência: justificativa, protocolo e aplicações 1

Imunomarcação de filamentos de actina em células de cardiomiócitos (Fonte: Ps1415 [CC BY-SA 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0)] via Wikimedia Commons)

Essa técnica, principalmente qualitativa (com algumas variantes quantitativas), tem a ver especificamente com a visualização de uma amostra pelo sinal produzido por um fluoróforo, que é uma molécula fluorescente ligada a um anticorpo e capaz de ser excitada em um determinado comprimento de onda .

No contexto celular, é muito útil estudar a presença / ausência e localização subcelular de proteínas. A técnica foi inicialmente usada no cenário clínico para o diagnóstico de vírus como influenza e, posteriormente, para muitas outras doenças infecciosas.

É uma técnica de grande sensibilidade e, com o equipamento de microscopia apropriado, você pode ter uma resolução muito boa. Requer, para observação, o uso de microscópios confocais ou de epifluorescência.

No entanto, apesar de muito popular, pode apresentar alguns problemas importantes em relação à obtenção de fluorescência inespecífica que gera um certo “ruído” de fundo, o que geralmente limita a leitura adequada dos resultados.

Fundação

A imunofluorescência é baseada na exploração do fenômeno biológico da reação de interação entre um anticorpo e um antígeno. Tem a ver especificamente com a visualização ou detecção dessa reação, estimulando as moléculas fluorescentes a um comprimento de onda específico.

Um anticorpo é uma proteína de imunoglobulina secretada a partir de células B ativas e gerada especificamente contra um antígeno, ao qual pode se ligar com grande afinidade e especificidade. A imunofluorescência utiliza imunoglobulinas IgG, que são solúveis no soro sanguíneo.

Os anticorpos são moléculas de até 950 kDa compostas por duas cadeias peptídicas “Y” (pesadas) curtas (leves) e longas. As cadeias leve e pesada são divididas em dois domínios: uma variável capaz de reconhecer o antígeno e outra constante ou conservada, característica de cada espécie.

Os antígenos são funcionalmente definidos como moléculas que podem ser reconhecidas por um anticorpo e são principalmente proteínas. Quando um animal é exposto a um antígeno, os linfócitos do sistema imunológico são ativados, produzindo anticorpos específicos contra ele e que funcionam como um sistema de defesa.

Um antígeno, como uma proteína, por exemplo, pode ter mais de um epítopo ou local de reconhecimento para um anticorpo, pelo que o soro do animal exposto a um antígeno pode ter anticorpos policlonais contra diferentes regiões da mesma proteína.

A imunofluorescência, então, explora a capacidade de um animal produzir anticorpos policlonais contra um antígeno específico para purificá-lo e subsequentemente usá-lo para a detecção do mesmo antígeno em outros contextos.

Entre os corantes ou moléculas fluorescentes mais usados ​​para algumas técnicas de imunofluorescência estão o isotiocianato de fluoresceína (FITC), isotiocianato de tetrametilrodamina-5 e 6 (TRITC), muitas cianinas como Cy2, Cy3, Cy5 e Cy7 e corantes chamados Alexa Fluor® , como o Alexa Fluor®448.

Protocolo

O protocolo de imunofluorescência varia dependendo de muitos fatores, no entanto, e em geral, abrange uma sequência linear de etapas que consiste em:

  • Preparação de folhas e células
  • Fixação da amostra
  • Permeabilização
  • Bloquear
  • Imunocoloração ou imunomarcação
  • Montagem e observação

-Preparação

Das amostras

A preparação da amostra dependerá de sua natureza e do tipo de experiência a ser realizada. A seguir, será explicado o caso mais simples, que envolve o uso de células em suspensão.

As células em suspensão, isto é, em um meio de cultura líquido, devem primeiro ser separadas por centrifugação e depois devem ser lavadas com um tampão isosmótico ou tampão que preserva sua integridade.

Normalmente, é utilizado um tampão fosfato-salino conhecido como PBS, no qual as células são ressuspensas e essa mistura é centrifugada novamente para obter as células livres do meio de cultura, que pode ter substâncias interferentes.

Dos lençóis

As folhas usadas para observação microscópica, onde as células serão posteriormente fixadas para os tratamentos a jusante correspondentes, também devem ser cuidadosamente preparadas.

Estes são cobertos ou “sensibilizados” com uma solução de polilisina, um polímero sintético que atuará como uma “cola molecular” entre as células e o suporte sólido, graças à interação eletrostática entre as cargas positivas de seus grupos amino e cargas negativas das proteínas que revestem as células.

Fixação da amostra

Esse processo consiste em imobilizar as proteínas encontradas no interior da célula para manter intacta sua localização espacial. As moléculas utilizadas devem ser capazes de passar por todos os tipos de membranas celulares e formar estruturas com proteínas covalentes.

Formaldeído e paraformaldeído, glutaraldeído e até metanol são amplamente utilizados, com os quais as amostras de células são incubadas por um certo tempo e depois lavadas com uma solução tampão isosmótica.

Após a fixação das células, elas continuam a ser anexadas às folhas previamente sensibilizadas com poli-lisina.

Permeabilização

Dependendo do tipo de teste realizado, será necessário permeabilizar ou não as células em estudo. Se o que se busca é conhecer a localização, presença ou ausência de uma determinada proteína na superfície celular, a permeabilização não será necessária.

Por outro lado, se você quiser saber a localização de uma proteína dentro da célula, a permeabilização é essencial e consistirá na incubação das amostras com Triton X-100, um detergente capaz de permeabilizar as membranas celulares.

Bloquear

Um passo fundamental em todas as técnicas imunológicas é o bloqueio. Nesta fase do procedimento, o bloqueio consiste em cobrir, nas folhas sensibilizadas, todos os locais com moléculas de poli-lisina às quais nenhuma célula aderiu. Ou seja, impede qualquer união inespecífica.

Normalmente para o bloqueio, são utilizadas soluções com albumina de soro bovino (BSA) em tampão PBS e os melhores resultados são obtidos quanto maior o tempo de incubação com esta solução. Após cada etapa, incluindo o bloqueio, a solução restante deve ser removida por lavagem.

Imunocoloração ou imunomarcação

O procedimento de imunocoloração ou imunocoloração dependerá principalmente se for uma imunofluorescência direta ou indireta (veja abaixo).

Se for uma imunofluorescência primária ou direta, as amostras serão incubadas com os anticorpos desejados, que devem ser acoplados aos corantes fluorescentes. O procedimento de incubação consiste em diluir o anticorpo em uma solução que também conterá BSA, mas em uma proporção menor.

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Quando o caso é de uma imunofluorescência secundária ou indireta, duas incubações consecutivas devem ser realizadas. Primeiro com os anticorpos desejados e depois com os anticorpos capazes de detectar as regiões constantes das imunoglobulinas primárias. São esses anticorpos secundários que estão covalentemente ligados aos fluoróforos.

A técnica é muito versátil, permitindo a marcação simultânea de mais de um antígeno por amostra, desde que haja anticorpos primários acoplados a diferentes fluoróforos, no caso de imunofluorescência direta.

Para marcações simultâneas na imunofluorescência indireta, é necessário garantir que cada anticorpo primário seja produzido em um animal diferente, bem como que cada anticorpo secundário seja acoplado a um fluoróforo diferente.

Como o bloqueio, a incubação com os anticorpos fornece melhores resultados quanto mais tempo for. Após cada etapa, é necessário lavar o excesso de anticorpos que não se ligaram às amostras e, na imunofluorescência secundária, é necessário bloquear antes de adicionar o anticorpo secundário.

Certas técnicas usam outros corantes que não têm relação com a imunomarcação, como a coloração do DNA nuclear com fluoróforo DAPI.

Montagem e observação

Durante o tempo final de incubação com fluoróforos, é necessário que as amostras permaneçam no escuro. Para observação microscópica, é comum o uso de algumas substâncias para preservação da fluorescência de fluoróforos acoplados a anticorpos.

Tipos

Imunofluorescência: justificativa, protocolo e aplicações 2

Resumo gráfico da imunofluorescência direta e indireta (Fonte: Westhayl618 [CC BY-SA 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0)] via Wikimedia Commons)

Imunofluorescência direta ou primária

Tem a ver com a detecção de antígenos através do uso de anticorpos fluorescentes. A principal vantagem do uso dessa técnica é sua velocidade, no entanto, muitos casos de ligação inespecífica podem ocorrer no processo, principalmente no estudo de soros humanos, pois são ricos em anticorpos muito heterogêneos.

Imunofluorescência indireta ou secundária

Também é conhecida como técnica “sanduíche” e isso envolve o desenvolvimento da técnica em duas etapas. O primeiro tem a ver com o uso de um anticorpo não fluorescente e sua ligação ao antígeno de interesse.

Contra a região constante deste primeiro anticorpo (que agora servirá como antígeno), é utilizado um segundo anticorpo capaz de reconhecê-lo, associado a uma molécula fluorescente.

A aparência de um sinal fluorescente será o resultado de um reconhecimento específico entre o primeiro anticorpo não fluorescente e o antígeno de interesse; a presença desse primeiro anticorpo determina a do segundo, que é marcado e graças à qual a presença ou ausência do antígeno pode ser determinada.

Apesar de ser uma técnica que consome muito mais tempo do que a imunofluorescência direta (inclui mais uma etapa de incubação), essa técnica não envolve o design de um anticorpo fluorescente para cada antígeno estudado, o que resulta em termos econômicos, mais viável

Além disso, é uma técnica mais sensível em termos de amplificação de sinal, uma vez que mais de um anticorpo secundário pode se ligar à região constante do anticorpo primário, amplificando a intensidade do sinal fluorescente.

Aplicações

Como pode ser observado anteriormente, a imunofluorescência é uma técnica extremamente versátil, que tem recebido vários usos nos campos científico e clínico. Pode ser usado para responder a perguntas ecológicas, genéticas e fisiológicas relacionadas a muitos organismos.

Dentre as aplicações clínicas, é utilizado para o diagnóstico direto de algumas doenças dermatológicas, seja por imunofluorescência direta ou indireta no tecido epitelial dos pacientes estudados.

Técnicas de imunofluorescência em organismos unicelulares, como leveduras, estão disponíveis para visualizar microtúbulos intranucleares e citoplasmáticos, actina e proteínas associadas, filamentos de 10 nm e outros constituintes do citoplasma , membrana e paredes celulares.

Referências

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