Meio Löwenstein-Jensen: fundação, preparação e uso

O meio Löwenstein-Jensen é um meio sólido seletivo para o isolamento e desenvolvimento de bactérias do gênero Mycobacterium, como Mycobacterium tuberculosis , M. avium , entre outros, com exceção das espécies de hanseníase, que não são cultiváveis.

As bactérias do gênero Mycobacterium não crescem em meios de cultura convencionais, portanto, foi necessário projetar um meio especial para seu isolamento. O meio original foi criado por Löwenstein e modificado por Jensen.

Meio Löwenstein-Jensen: fundação, preparação e uso 1

Meio de Löwenstein-Jensen com colônias de Mycobacterium tuberculosis. Fonte: Agarwal et al / BioMed Central Ltd., cortesia da Biology Image Library

A modificação consistiu na eliminação do corante vermelho do Congo, substituindo-o por uma maior concentração de verde malaquita. Também alterou as concentrações de citrato de magnésio e fosfato monopotássico.

Atualmente, o meio Löwenstein-Jensen contém amido de batata, asparagina, citrato de magnésio, fosfato monopotássico, sulfato de magnésio, verde malaquita, ácido nalidíxico, ciclo-heximida, lincomicina, ovos batidos, glicerina e água.

As micobactérias são normalmente isoladas de locais não estéreis, como expectoração, urina, abscessos, entre outros. Isso significa que a maioria das amostras conterá a microbiota usual na área, além do patógeno.

É por isso que o meio Löwenstein-Jensen contém uma série de inibidores em sua composição representados por verde malaquita, antibióticos e antifúngicos.

Além disso, as amostras não esterilizadas do local devem ser descontaminadas e neutralizadas antes de serem plantadas no meio Löwenstein-Jensen.

Fundação

A presença de ovo e glicerina no meio Löwenstein-Jensen estimula o crescimento de micobactérias, pois fornecem os ácidos graxos e proteínas necessários para o desenvolvimento desses microrganismos.

O meio Löwenstein-Jensen contém verde malaquita, que é um inibidor da microbiota que o acompanha. Mas também contém ácido nalidíxico (35 µg / mL), que inibe a microbiota Gram-negativa, ciclo-heximida (400 µg / mL), que inibe fungos e leveduras saprófitas e leveduras e lincomicina (2 µ / mL), que inibe a microbiota Gram-positiva.

Algumas casas comerciais preferem adicionar a seguinte combinação de antibióticos: polimixina B 200.000 unidades / L, anfotericina B 10 mg / L, carbenicilina 50 mg / L e trimetoprim 10 mg / L.

Este meio não contém ágar, portanto a solidificação do meio ocorre pela coagulação da albumina presente no ovo durante a esterilização.

Preparação

Pesar 37,3 g do meio desidratado em 600 ml de água destilada à qual foram adicionados anteriormente 12 ml de glicerol. A mistura é aquecida, mexendo frequentemente até dissolver completamente. Autoclave o meio a 121 ° C por 15 minutos.

Por outro lado, uma suspensão homogênea de 1000 ml de ovos frescos deve ser preparada em condições assépticas. Adicione a suspensão do ovo a 600 ml de meio preparado a uma temperatura de 50 – 60 ° C, evitando bolhas de ar.

Soluções antibióticas também são adicionadas após a esterilização na autoclave.

Despeje o meio em tubos de ensaio estéreis com tampa de rosca. Aqueça os tubos a 85 ° C por 45 minutos em uma posição inclinada.

A cor do meio preparado é verde-água-marinha e pode ter manchas esbranquiçadas devido à presença de lipídios do ovo.

O pH do meio deve ser 7,2 ± 0,2

Guarde os tubos na geladeira e protegidos da luz direta até o uso. Revenimento antes da semeadura.

Há uma modificação do meio chamado “modificação de Gruft do Löwenstein Jensen”. Ele contém os mesmos compostos que o meio clássico, mas é adicionado RNA-5mg / 100 mL e, como inibidores, contém 0,025 g / 100 mL de verde malaquita, 50 U / mL de penicilina e 35 ug / mL de ácido nalidíxico.

Usos

O meio Löwenstein-Jensen é utilizado para o isolamento de micobactérias, de vários tipos de amostras. Recomenda-se a realização de uma coloração de Ziehl-Neelsen em qualquer amostra em que se suspeite da presença de micobactérias.

Algumas amostras vêm de locais estéreis, mas outras não. As amostras não estéreis devem ser descontaminadas conforme apropriado:

Escarro

As amostras de escarro devem ser descontaminadas da seguinte forma: determinar a quantidade de amostra de escarro em ml e adicionar a mesma quantidade de NaOH a 4% à amostra e incubar a 37 ° C.

Mexa a mistura com frequência por um período de 30 minutos. Em seguida, centrifugue a 3000 RPM por 30 minutos.

Descarte o sobrenadante sobre uma solução de desinfetante fenólico. Use o sedimento para semear, mas primeiro o pH deve ser neutralizado.

Para neutralizar o sedimento usando H 2 SO 4 a 5% na presença do indicador vermelho de fenol para tomar um valor de pH neutro, resultante em uma salmão.

Lavagem gástrica, lavagem brônquica e aspirado brônquico

Nesse caso, a amostra deve ser centrifugada a 3000 RPM por 30 minutos. O sobrenadante é descartado e o sedimento é usado. Para descontaminar o sedimento, adicione 3 ml de NaOH a 4% e mexa frequentemente a 37 ° C por um período de meia hora.

Centrifugue novamente, o sobrenadante é descartado e o sedimento é usado. Este último deve ser neutralizado conforme explicado na amostra de escarro.

Urina

Deixe a amostra assentar na geladeira por 24 horas. Separe o sobrenadante. O sedimento restante deve ser centrifugado por 30 minutos a 3000 RMP. Descarte o sobrenadante novamente e reconstitua o sedimento com 3 ml de solução fisiológica estéril.

Adicione 3 ml de NaOH a 4% e proceda à descontaminação e neutralização como descrito acima.

Ascite, líquido pleural, líquido cefalorraquidiano

Neste tipo de amostra é centrifugada e o sobrenadante é descartado. Realize um grama no sedimento ou observe diretamente no microscópio; se não forem observadas bactérias, a etapa de descontaminação e a etapa de neutralização não são necessárias.

Nesse caso, a amostra pode ser semeada diretamente usando o sedimento. Se houver bactérias, continue a descontaminar e neutralizar como descrito acima.

Biópsias

A este tipo de amostra, 5 ml de água destilada devem ser adicionados e depois centrifugados a 1500 RPM por 10 minutos. Descarte o sobrenadante e re-centrifugue o sedimento a 3500 RPM por 30 minutos. Use o sedimento para semear o meio de cultura.

Swab laríngeo

O swab deve ser introduzido em um tubo estéril contendo partes iguais de água destilada e NaOH a 4%. O cotonete deve ser pressionado nas paredes do tubo para que a amostra seja diluída no líquido. Centrifugar e usar o sedimento. Neutralize o sedimento como já descrito.

Semeado

O meio de Löwenstein-Jensen é inoculado adicionando 0,5 ml da amostra à superfície do meio. Gire o tubo para distribuir a amostra pelo meio. Não use alça de platina.

Um segundo tubo contendo o meio Stonebrink pode ser semeado para isolar o Mycobacterium bovis e outras espécies que não crescem no meio Löwenstein-Jensen.

Incubação

Os tubos inoculados são incubados em aerobiose a 37 ° C, com a tampa levemente frouxa e inclinada a aproximadamente 5 ° e protegida da luz. O ambiente pode ser enriquecido com 5 a 10% de dióxido de carbono. Verifique as colheitas duas vezes por semana até o aparecimento de colônias.

Quando a amostra é absorvida, as tampas são ajustadas. O tempo máximo de incubação é de 8 semanas, se após esse período não houver crescimento, será relatado como negativo.

Controle de qualidade

Como controle de qualidade, as seguintes linhagens podem ser usadas:

Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294, Mycobacterium kansasii ATCC 12478, Mycobacterium avium ATCC 19291, Mycobacterium bovis ATCC 19219, Mycobacterium fortuitum ATCC 6841, Escherichia coli ATCC 25922, Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Cryptococcus neoformans ATCC 32045

Para as três primeiras espécies mencionadas, é esperado um excelente desenvolvimento, para M. fortuitum o crescimento deve ser bom, enquanto para M. bovis , é esperado pouco ou nenhum crescimento. Enquanto isso, outras espécies que não o gênero Mycobacterium devem ser completamente inibidas.

Limitações

O meio preparado deve ser protegido da luz; a exposição prolongada à luz faz com que o meio passe de verde para azul; nesse caso, o meio não pode mais ser usado. Isso ocorre porque o verde malaquita é fotossensível.

O meio, pois contém ovo, pode ser facilmente contaminado se não for manuseado assepticamente. Pode ser dissolvido se estiver contaminado com bactérias proteolíticas.

O cultivo e a manipulação de bactérias do gênero Mycobacterium requerem pessoal qualificado, ciente das medidas de biossegurança que devem ser seguidas para evitar contaminação ou contaminação de outras pessoas.

O HCl não deve ser utilizado na etapa de neutralização devido à formação de cloreto de sódio, que pode ser tóxico para o bacilo de Koch.

As amostras devem ser mantidas refrigeradas e protegidas da luz enquanto não estiverem sendo processadas.

Referência

  1. Laboratórios Francisco Soria Melguizo. 2009. Meio seletivo Löwenstein-Jensen. Disponível em: f-soria.es
  2. Laboratórios britânicos. 2017. Meio Löwenstein-Jensen. Disponível em: britanialab.com.
  3. Laboratórios Neogen Meio Löwenstein-Jensen. Disponível em: foodsafety.neogen.com.
  4. «Meio de Löwenstein-Jensen.» Wikipedia, A enciclopédia livre . 20 Nov 2018, 15:15 UTC. 24 de abr de 2019 às 18:34 wikipedia.org
  5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnóstico microbiológico 5a ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
  6. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnóstico microbiológico de Bailey & Scott. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
  7. Mac Faddin J. (2003). Testes bioquímicos para a identificação de bactérias de importância clínica. 3rd ed. Editora Panamericana. Bons ares. Argentina

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