Meio OF: justificativa, preparação, usos e limitações

O meio de fermentação OF ou glicose é um ágar semi-sólido especialmente desenvolvido para o estudo do metabolismo oxidativo e fermentativo dos carboidratos em um importante grupo de microrganismos que não as enterobactérias, chamados bacilos Gram-negativos não entéricos.

Foi criado por Hugh e Leifson; Esses pesquisadores perceberam que os meios convencionais para estudar a produção de ácidos a partir de carboidratos não eram adequados para esse grupo específico de bactérias.

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A. Linha de base comercial média de OF. B. Tubos com meio semeado. Fonte: A e B Fotos tiradas pelo autor MSc. Marielsa Gil.

Isso ocorre porque bacilos Gram-negativos não entéricos geralmente produzem baixas quantidades de ácidos, diferentemente das enterobactérias.

Nesse sentido, o meio OF possui características especiais que podem detectar as pequenas quantidades de ácido formado, tanto pelas vias oxidativas quanto pelas fermentativas. Essas diferenças estão relacionadas à quantidade de peptonas, carboidratos e ágar.

Este meio contém menor quantidade de peptonas e uma maior concentração de carboidratos, diminuindo assim os produtos que alcalinizam o meio como resultado do metabolismo das proteínas e a produção de ácidos é aumentada pelo uso de carboidratos.

Por outro lado, a diminuição da quantidade de ágar favorece a disseminação do ácido produzido pelo meio, além de permitir a observação da motilidade.

O meio OF é composto de peptona, cloreto de sódio, azul de bromotimol, fosfato dipotássico, ágar e carboidrato. O carboidrato mais comum é a glicose, mas outros podem ser usados ​​de acordo com o que você deseja estudar, como lactose, maltose, xilose, entre outros.

Fundação

Como qualquer meio de cultura, o meio OF deve conter nutrientes que garantam o crescimento bacteriano; Essas substâncias são peptonas.

Por outro lado, o carboidrato fornece energia e, ao mesmo tempo, serve para estudar o comportamento do microrganismo à sua frente, ou seja, permite que a bactéria seja classificada como organismo oxidativo, fermentativo ou não sacarolítico.

O meio OF contém uma proporção peptona / carboidrato de 1: 5, em oposição aos meios 2: 1 convencionais. Isso garante que a quantidade de aminas alcalinas formadas a partir da degradação das peptonas não neutralize a formação de ácidos fracos.

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Por outro lado, o meio contém cloreto de sódio e fosfato dipotássico. Estes compostos estabilizam osmoticamente o meio e regulam o pH, respectivamente. O azul de bromotimol é o indicador de pH, que muda a cor do meio de verde para amarelo com a produção de ácido.

Alguns microrganismos podem usar carboidratos pela via oxidativa ou fermentativa, enquanto outros não.

Isso depende da característica de cada microorganismo. Por exemplo, alguns microorganismos aeróbicos estritos podem oxidar certos carboidratos, e os anaeróbios facultativos podem oxidar e fermentar dependendo do ambiente circundante, enquanto outros não oxidam ou fermentam carboidratos (asacarolíticos).

Finalmente, há uma modificação do meio OF recomendado pelo CDC que contém uma base OF especial com vermelho de fenol como indicador.

Processo de oxidação

O processo de oxidação da glicose não requer fosforilação da glicose, como no processo de fermentação. Nesse caso, o grupo aldeído é oxidado em um grupo carboxila, resultando em ácido glucônico. Por sua vez, é oxidado a 2-cetoglucônico.

Este último acumula ou degrada para duas moléculas de ácido pirúvico. Este sistema requer a presença de oxigênio ou algum composto inorgânico como o aceitador final de elétrons.

A produção de ácidos por esta via é mais fraca que a obtida pela via fermentativa.

Processo de fermentação

Para que a fermentação da glicose ocorra através de qualquer uma das vias disponíveis, ela deve primeiro ser fosforilada, tornando-se glicose-6-fosfato.

A fermentação da glicose pode tomar várias rotas, a principal delas é a rota Embden-Meyerhof-Parnas, mas também pode seguir a rota Entner-Doudoroff, ou a rota monofosfato de hexose Warburg-Dickens, também conhecida como via da degradação de pentoses.

A via escolhida dependerá do sistema enzimático que o microrganismo possui.

Via Embden-Meyerhof – Hotéis de Parnas

Na fermentação da glicose pela rota Embden-Meyerhof-Parnas, ela é desdobrada em duas moléculas de triosa, para depois ser degradada em vários compostos de carbono, até a formação de gliceraldeído-3-fosfato. A partir daí, uma substância intermediária, que é o ácido pirúvico, se origina.

A partir daí, serão formados vários tipos de ácidos mistos que podem variar de uma espécie para outra.

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Este sistema ocorre na ausência de oxigênio e precisa de um composto orgânico como aceitador final de elétrons.

Rota de Entner-Doudoroff

Na fermentação da glicose pela via de Entner-Doudoroff, o 6-fosfato de glicose passa para o glucono-lact-lactona-6-fosfato e a partir daí é oxidado em 6-fosfogluconato e 2-ceto-3-desoxi-6- fosfogluconato, para finalmente formar ácido pirúvico. Essa rota precisa de oxigênio para glicólise.

Via de degradação de pentoses ou via do hexofa monofosfato de Warburg-Dickens

Esta rota é um híbrido dos 2 anteriores. Começa de maneira semelhante à via Entner-Doudoroff, mas o gliceraldeído-3-fosfato é subsequentemente formado como precursor do ácido pirúvico, como ocorre na via de Embden-Meyerhof-Parnas.

Preparação

Pesar:

2 gr de peptona

5 g de cloreto de sódio

10 gr de D-glicose (ou carboidrato a ser preparado)

0,03 g de azul de bromotimol

Ágar 3 gr

0,30 g de fosfato dipotássico

1 litro de água destilada.

Misture todos os compostos, exceto carboidratos, e dissolva em 1 litro de água destilada. Aqueça e mexa até dissolver completamente.

Quando arrefecido a 50 ° C, são adicionados 100 ml de glicose a 10% (filtrada).

Distribua assepticamente 5 ml de meio OF em tubos de ensaio com uma tampa de algodão e autoclave a 121 ° C, a 15 libras de pressão por 15 minutos.

Deixe solidificar na posição vertical.

O pH do meio deve ser 7, 1. A cor do meio preparado é verde.

Guarde na geladeira

Usos

O meio OF é um meio especial para determinar o comportamento metabólico de um microorganismo contra um carboidrato. Especialmente para aqueles que formam ácidos de maneira ruim, fraca ou nula.

Semeado

Para cada microrganismo são necessários 2 tubos OF, ambos devem ser inoculados com o microrganismo a ser estudado. A colônia é tomada com uma alça reta e uma punção é feita no centro do tubo sem atingir o fundo; Várias punções podem ser feitas, desde que não seja interessante observar a motilidade.

Uma camada de petrolato líquido estéril ou parafina derretida estéril (aproximadamente 1 a 2 ml) é adicionada a um dos tubos e rotulada com a letra “F”. O outro tubo é deixado original e rotulado com a letra “O”. Ambos os tubos são incubados a 35 ° C e observados diariamente por até 3 a 4 dias.

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Interpretação

Metabolismo e produção de gás

Tabela: Classificação dos microrganismos de acordo com o seu comportamento nos tubos OF abertos (oxidativos) e fechados (fermentativos)

Meio OF: justificativa, preparação, usos e limitações 2

Fonte: Realizado pelo autor MSc. Marielsa Gil

O gás é observado com a formação de bolhas ou deslocamento do ágar.

Note-se que um organismo que apenas oxida a glicose, mas não a fermenta, não será capaz de fermentar outros carboidratos; em qualquer caso, apenas a oxidará. Portanto, nesta situação, o tubo selado para o estudo de outros carboidratos será omitido.

Motilidade

Além disso, a motilidade pode ser vista no meio OF.

Motilidade positiva : crescimento que não se limita à zona de inoculação. Há crescimento para os lados do tubo.

Motilidade negativa : crescimento apenas no inóculo inicial.

Controle de qualidade

As seguintes linhagens podem ser usadas como controle de qualidade: Escherichia coli , Pseudomonas aeruginosa e Moraxella sp. Os resultados esperados são:

  1. coli : fermentador de glicose (tubos amarelo e gás).
  2. aeruginosa : Oxidador de glicose (tubo aberto amarelo e selo verde ou azul).
  3. Moraxella sp: Sem sacarolítico (tubo aberto verde ou azul, tubo selado verde).

Limitações

-Alguns microrganismos não podem crescer no meio OF. Nestes casos, o teste é repetido, mas 2% de soro de leite ou 0,1% de extrato de levedura são adicionados ao meio.

As reações de oxidação são frequentemente observadas apenas perto da superfície e o restante do meio pode ser verde, da mesma forma que é considerado positivo.

Referências

  1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnóstico microbiológico 5a ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
  2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnóstico microbiológico de Bailey & Scott. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
  3. Mac Faddin J. (2003). Testes bioquímicos para a identificação de bactérias de importância clínica. 3rd ed. Editora Panamericana. Bons ares. Argentina
  4. Laboratórios Francisco Soria Melguizo. 2009. OF Glucose Medium. Disponível em: http://f-soria.es
  5. Laboratórios Conda Pronadisa. De meio de glicose. Disponível em: condalab.com
  6. Laboratórios BD 2007. OF Medium Basal. Disponível em: bd.com

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