Xanthomonas campestris: descrição, cultivo e patologias

Xanthomonas campestris é uma espécie de proteobactéria (classe: Gamma Proteobacteria, ordem: Xantomonadales, família: Xanthomonadaceae) fitopatogênica que afeta importantes culturas.

X. campestris apresenta uma fase epifítica na planta em que não o prejudica. Esta fase é anterior à infecção, é gerada pela proliferação de bactérias devido a variações ambientais favoráveis. A infecção com esta espécie ou casiona uma variedade de sintomas na planta infectada que podem eventualmente degenerar em morte.

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Figura 1. Sintomatologia causada por infecção por X. campestris. Fonte: autor Ninjatacoshell, Wikimedia Commons.

X. campestris também é bem conhecido por produzir o biopolímero de xantana ou goma xantana , um polissacarídeo que excreta no meio (exopolissacarídeo) e aumenta a viscosidade das soluções aquosas.

O exopolissacarídeo de xantano foi o primeiro bioproduto comercialmente importante gerado pelos processos de fermentação do amido de milho. Atualmente, é produzido em grandes quantidades e possui muitas aplicações por suas características como espessante e emulsificante. O xantano é usado na indústria alimentícia, farmacêutica, cosmética, agrícola, de petróleo, entre outros.

Descrição do produto

Xanthomonas campestris é um bacilo gram-negativo, saprófito aeróbico e facultativo obrigatório. É móvel, com 0,2 a 0,6 µm de largura e entre 0,8 e 2,9 µm de comprimento. Pode ser apresentado como um indivíduo solitário ou formando filamentos, cercado por xantano, o exopolissacarídeo que produzem.

O Xanthan promove a formação de biofilmes de X. campestris e também exerce uma ação protetora nas comunidades estabelecidas nessa estrutura, quando ocorrem mudanças bruscas de temperatura, pH, radiação ultravioleta, variações osmóticas acentuadas e / ou diminuição da umidade.

Interação com a planta

Esta espécie possui vários mecanismos para evitar as respostas de defesa das plantas que infecta. A primeira barreira da planta a uma infecção bacteriana é a parede celular e as substâncias da superfície com atividade antimicrobiana.

X. campestris pode infectar a planta através de seus estômatos foliares (poros onde ocorrem trocas gasosas com o meio ambiente), seus hidratos (um tipo de estoma em que o excesso de água exala) ou feridas presentes.

Geralmente as plantas fecham seus estômatos quando atacadas por microorganismos. No entanto, X. campestris produz um fator de virulência que impede o fechamento dos estômatos, favorecendo a entrada de mais bactérias na planta do ambiente externo.

Quando as bactérias são encontradas no interior da planta, elas impedem o transporte de água, obstruindo os tecidos vasculares. O resultado é a necrose das folhas e a murcha das partes infectadas.

Além disso, X. campestris produz um composto chamado glucano cíclico neutro β- (1,2) que impede a expressão de genes de defesa na planta. Esses compostos podem estar associados ao espaço periplásmico bacteriano ou podem ser excretados no ambiente extracelular, favorecendo a mobilidade das bactérias, sua virulência e a formação de biofilmes .

Xanthan

O xantano produzido pelo Xanthomonas atua como fator de virulência, suprimindo a resposta imune da planta infectada e aumentando a capacidade de infecção bacteriana.

O xantano é um polissacarídeo que consiste em unidades de 5 açúcares que são repetidos (2 glicoses, 2 mangas e 1 ácido glucurônico) e polimerizados.

A síntese do xantano depende de um operon chamado goma de cluster (um conjunto de genes que compõem uma unidade funcional), que possui 12 genes que estão sob o controle de uma única região promotora.

Isolamento de X. campestris de tecido vegetal

X. campestris pv. campestris pode ser isolado de tecido foliar com manchas em “V” ou tecido vascular danificado ou pescoço da planta, ou seja, das áreas lesadas da planta.

Para obter cepas de X. campestris , a área lesada é selecionada como mostrado (manchas nas folhas ou nos frutos ou chancros). Se nenhuma lesão for observada na planta, o tecido mais suscetível a danos é coletado como mostrado e analisado pelos meios de cultura e pela técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR).

Meios de cultura

Entre os meios de cultura utilizados estão os seguintes:

Interpolação de leite (MT)

Para um isolamento inicial de microrganismos a partir de amostras de tecido vegetal, o meio Milk Tween (MT) pode ser aplicado :

10 ml de leite desnatado, 0,25 g de CaCl 2 , 10 g de peptona protease nº 3, 15 g de ágar Bacto, 0,5 g de tirosina, 10 ml de Tween 80, 80 mg de cefalexina (em 2 ml de NaOH a 4%), 200 g de ciclo-heximida (em 2 ml de 75% de metanol), 100 mg de vancomicina (em 1 ml de água destilada).

As soluções de leite desnatado, cefalexina, ciclo-heximida e vancomicina devem ser esterilizadas por filtração e adicionadas ao meio a 50 ° C.

Rei B

Após o crescimento das colônias bacterianas no MT, o mais semelhante ao X. campestris (colônias de pigmentação amarela às 72 e 120 horas de cultura) pode ser passado para o meio B de King :

20 g de proteose peptona N ° 3, 20 g de agar-agar, K 2 HPO 4 1,5 g, MgSO 4 x / H 2 O 1,5 g, 10 ml de glicerol, 700 de água destilada.

O meio deve ser aquecido a 80 ° C com agitação, preenchido com 1 L de água destilada e homogeneizado, e o pH deve ser ajustado para 7,2. Esterilizar a 121 ° C por 15 minutos.

O rico meio de cultura PYM ou YMM também tem sido utilizado no cultivo de X. campestris .

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Figura 2. Cultura de Xanthomonas em meio sólido. Fonte: Jarober3 [GFDL (http://www.gnu.org/copyleft/fdl.html) ou CC BY-SA 3.0 (https://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0)], via Wikimedia Commons

PYM

Para preparar o PYM , para cada 1000 ml de volume total, 10 gramas de glicose, 5 gramas de extrato de peptona, 3 gramas de extrato de malte e 3 gramas de fermento devem ser adicionados.

Se desejar crescer em meio sólido em placas de Petri, 15 gramas de ágar também devem ser adicionados à mistura.

YMM

Para preparar o meio YMM , é necessário por 1000 ml de volume total: 10 g de glucose, 1 mL de solução de MgSO 4 : 7H 2 O (10 g / L), 1 mL de uma solução de CaCl 2 (22 g / L ), 1 ml de uma solução de K 2 HPO 4 (22 g / L), 1 mL de uma solução de FeCl 3 em 0,1 m HCl (2 g / L), casaminoácidos a 0,3% m / v (a partir de ácidos aminados hidrólise de caseína) e solução de glutamato de sódio a 11% v / v.

Condições de incubação

As condições de incubação das cepas bacterianas de X. campestris devem ser de 27 ou 28 ° C e, no caso de meios de cultura líquidos, a agitação contínua deve ser mantida a 200 rotações por minuto (rpm).

Produção Xantana

Se a produção de xantano for desejada em um processo de fermentação, ela deve ser fornecida como fonte de glicose de carbono, sacarose ou xarope de milho (entre 20 e 40 g / L), entre outros nutrientes que fornecem nitrogênio.

Detecção de atividade metabólica

Para detectar a presença de X. campestris viável no tecido da planta, alguns pesquisadores recomendam medir a atividade metabólica, em vez do crescimento microbiano na cultura de laboratório.

A medição da atividade metabólica foi realizada utilizando um indicador de viabilidade através do sistema de transporte de elétrons. Esse composto é chamado tetrazólio e seus sais aceitam elétrons de hidrogênio, gerando formazan, uma substância insolúvel em água. Assim, a aparência no meio de formazan é um indicador da atividade metabólica celular.

Um dos meios de cultura de X. campestris para realizar este teste de viabilidade contém cloreto de tetrazólio (TTC), cloreto de trifenil tetrazólio e outros aditivos, como cloreto de sódio e açúcares. É um meio com as seguintes substâncias para 500 ml de volume total: 5 g de peptona, 0,5 g de caseína hidrolisada, 2,5 g de glicose e 8,5 g de ágar.

Fisiopatologia

A bactéria X. campestris é um agente causador de inúmeras doenças que afetam as folhas de plantas ornamentais (como Anthurium andreanum ) e feijão ( Phaseolus vulgaris L.). Também afetam os frutos de árvores frutíferas, como amêndoa, nectarina, cereja, pêssego, damasco, ameixa, entre outras.

Sabe-se que X. campestris afeta a família Brassicaceae ou crucífera, estando entre as 10 espécies fitopatogênicas mais perigosas para a atividade agrícola, principalmente nos trópicos.

Por exemplo, X. campestris produz doença da podridão negra em couve-flor ( Brassica oleracea ), brócolis ( B. napus ), couve chinesa ( B. pekinensis ), nabo ( B. rapa ) e mostarda ( B nigra ), rabanete ( Rhaphanus sativus ) e couve ( B. fruticulosa ).

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Figura 3. Folha afetada por X. campestris. Fonte: David B. Langston [CC BY 3.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/3.0)], via Wikimedia Commons

Os sintomas produzidos por X. campestris aparecem inicialmente nas folhas e depois podem aparecer nos frutos e nos galhos. Eles envolvem manchas irregulares e angulares das folhas amareladas (1 a 5 mm de diâmetro) limitadas pelas costelas que finalmente se tornam necróticas.

Também ocorrem queimaduras foliares; manchas de frutas; murcha vascular e aparecimento de lesões cloróticas ou necróticas na forma de “V”.

As manchas aparecem nas bordas das folhas e circundam o nervo central. Pode ocorrer perda de folhas na planta. Nas frutas aparecem manchas verdes que são necróticas, e também podem quebrá-las. Chancros também podem ocorrer.

Referências

  1. Dow, JM, Crossman, L., Findlay, K., He, Y.-Q., Feng, J.-X. & Tang, J.-L. (2003). A dispersão de biofilme em Xanthomonas campestris é controlada pela sinalização célula-célula e é necessária para a virulência total das plantas. Anais da Academia Nacional de Ciências, 100 (19), 10995-11000. doi: 10.1073 / pnas.1833360100
  2. Hayward, AC, Swings, JG e Civerolo, EL (1993). Xanthomonas Springer Holanda 407.
  3. Papagianni, M., Psomas, S., Batsilas, L., Paras, S., Kyriakidis, D. e Liakopoulou-Kyriakides, M. (2001). Produção de xantano por Xanthomonas campestris em culturas descontínuas. Process Bioquímica, 37 (1), 73–80. doi: 10.1016 / s0032-9592 (01) 00174-1
  4. Rosalam, S. & Inglaterra, R. (2006). Revisão da produção de goma xantana a partir de amidos não modificados por Xanthomonas campestris Enzyme and Microbial Technology, 39 (2), 197–207. doi: 10.1016 / j.enzmictec.2005.10.019
  5. Stewart, P. e Globig, S. (2011). Fitopatologia em plantas. Imprensa acadêmica da Apple 334.

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