Agar ETI: fundamento, preparação e utilizações

O ágar ETI ou ágar de ferro e açúcar triplo é um meio sólido, o qual serve como um teste bioquímico para guiar a identificação inicial de bactérias Gram-negativas. Baseia-se em evidências da fermentação dos açúcares presentes e da produção de sulfeto de hidrogênio e gás.

Sua composição e fundação é muito semelhante ao teste de ferro Kligler, com a diferença de que este último contém apenas glicose e lactose. Em vez disso, como o nome indica, o ágar-ferro com açúcar triplo contém três carboidratos fermentáveis: glicose, lactose e sacarose.

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Imagens do teste TSI com diferentes microrganismos A. Escherichia coli, B. Shigella flexneri, C) Salmonella typhimurium, D. Pseudomonas aeruginosa. Fonte: Witmadrid [domínio público], do Wikimedia Commons

Além disso, o meio TSI possui quatro derivados de proteínas que o tornam um ágar muito nutritivo: extrato de levedura, extrato de carne, peptona e peptona protéica. Também contém sulfato de amônio ferroso, tiossulfato de sódio , cloreto de sódio , vermelho de fenol e ágar.

A incapacidade de um microrganismo fermentar a glicose presente no ambiente imediatamente o exclui de pertencer à família Enterobacteriaceae. Portanto, esse teste é essencial para decidir qual rota de identificação deve ser adotada para determinar o gênero e a espécie.

Cada laboratório decide se trabalha com o ágar TSI ou com o ágar Kligler.

Fundação

Cada um dos compostos desempenha um papel no ambiente.

Cloreto de Sódio e Ágar

O cloreto de sódio é necessário para manter o equilíbrio osmótico do meio. Enquanto o ágar dá a consistência sólida.

Indicador de PH (vermelho de fenol)

O pH do meio preparado é equilibrado em 7,3 e o indicador de pH (vermelho de fenol) fica amarelo abaixo de 6,8. Isso significa que pequenas quantidades de ácidos produzidos pela fermentação dos açúcares transformarão o meio vermelho alaranjado em amarelo.

Se a fermentação não ocorrer, haverá alcalinização do meio pelo uso das peptonas, passando de vermelho-laranja para vermelho forte.

Derivados de proteínas (extrato de levedura, extrato de carne, peptona e proteína peptona)

Quando as bactérias metabolizam as proteínas presentes no ágar TSI, são produzidas aminas que alcalinizam o meio (principalmente no nível do chanfro), porque a reação precisa de oxigênio. As aminas fazem o chanfro ficar vermelho forte.

Mas isso vai depender da capacidade das bactérias fermentarem carboidratos ou não.

Fermentação de carboidratos (glicose, lactose e sacarose)

O estudo da fermentação do açúcar pode dar várias imagens e cada uma é interpretada de maneira diferente. A interpretação do teste divide os microrganismos em três categorias: fermentadores sem glicose, fermentadores sem lactose e fermentadores com lactose / sacarose.

Deve-se notar que a quantidade de glicose no meio é limitada, enquanto a concentração de lactose e sacarose é 10 vezes maior.

Bactérias da família Enterobacteriaceae e outros microrganismos fermentadores de glicose começarão a fermentar esse açúcar, porque é o carboidrato mais simples para energia.

Por outro lado, lactose e sacarose são carboidratos complexos que precisam ser decompostos e convertidos em glicose para que possam entrar no ciclo de Embden-Meyerhof.

Microrganismos não fermentativos da glicose

Quando o microorganismo inoculado não é capaz de fermentar glicose, muito menos pode fermentar outros carboidratos. Portanto, nenhum ácido é formado aqui, mas há formação de aminas no chanfro devido ao uso de peptonas.

Nesse caso, o painel fica vermelho mais forte e a parte inferior do tubo pode permanecer inalterada ou também alcalina, deixando todo o tubo vermelho.

Interpretação: K / K significa chanfro alcalino / fundo alcalino ou neutro

Na imagem encontrada no início do artigo, veja a imagem do tubo D.

Este resultado indica que o microrganismo não pertence à família Enterobacteriaceae.

-Microrganismos não fermentativos de lactose / sacarose

Se as bactérias forem capazes de fermentar glicose, mas não lactose ou sacarose, ocorrerá o seguinte:

A bactéria consumirá toda a glicose presente após aproximadamente 6 a 8 horas, podendo acidificar o chanfro e o taco; isto é, o ágar terá ficado completamente amarelo. Mas quando a glicose está esgotada e antes da impossibilidade de usar lactose e sacarose, a bactéria inicia o metabolismo das proteínas.

Essa reação precisa de oxigênio, portanto a degradação das peptonas ocorre na superfície (chanfro). As aminas produzidas alcalinizam o painel, ficando amarelo para vermelho. Esta reação é evidenciada entre 18 e 24 horas de incubação.

Interpretação: K / A significa chanfro alcalino e ácido taco.

Na imagem no início do artigo, veja a imagem do tubo B.

-Microrganismos fermentadores de lactose / sacarose

Microrganismos capazes de fermentar lactose e sacarose obviamente podem fermentar glicose. Depois que a quantidade mínima de glicose presente no meio é esgotada, o piruvato formado começa a ser metabolizado para formar ácidos através do ciclo aeróbico de Krebs e, no período de 8 a 12 horas, todo o meio fica amarelo.

Se as bactérias conseguirem desdobrar a lactose ou sacarose, os ácidos continuarão sendo produzidos e, após 18 a 24 horas, todo o tubo – chanfro e taco – continuará amarelo.

Deve-se notar que o uso de glicose é realizado de duas maneiras: uma na forma aeróbica no chanfro do tubo e a outra na forma anaeróbica no fundo do tubo.

Interpretação: A / A significa chanfro ácido / fundo ácido. Pode apresentar gás ou não.

Na imagem no início do artigo, veja a imagem do tubo A.

Produção de gás

Alguns microorganismos são capazes de produzir gás durante a fermentação de açúcares. O gás é evidenciado no tubo pela pressão que exerce dentro do ágar. A pressão causa a formação de bolhas ou o deslocamento do ágar. Às vezes, a formação de gás pode fraturar o ambiente.

É importante que, no momento da semeadura do meio da ETI, a punção seja realizada de forma limpa através do centro do ágar até atingir o fundo. Se a punção for desviada para as paredes do tubo, poderá causar falsos positivos na produção do gás, uma vez que escapará através do canal formado incorretamente.

A produção de gás, bem como as reações que ocorrem no chanfro do ágar, precisam de oxigênio, portanto, recomenda-se que o tubo seja tapado com um tampão de algodão e, se for usada uma tampa de baquelite, não deverá ser totalmente ajustado.

A produção de gás é relatada como positiva (+) ou negativa (-).

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Padrões de formação de gás. Fonte: Esquema elaborado pelo MSc. Marielsa Gil. Fonte das imagens: VeeDunnFlickr.com/Y_tambe [CC BY-SA 3.0 (https://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0)], via Wikimedia Commons

Tiossulfato de sódio e sulfato de amônio ferroso ( produção de sulfeto de hidrogênio)

As bactérias capazes de produzir sulfeto de hidrogênio (gás incolor) absorvem o enxofre do tiossulfato de sódio presente no meio. Uma vez formado o H 2 S reage com sulfato de amónio ferroso, sulfureto de ferro produzindo (precipitado preto claramente visível).

A produção de H 2 S é classificado como positivo (+) ou negativa (-).

Na imagem encontrada no início do artigo, veja a imagem do tubo C.

Preparação

Pesar 62,5 g do ágar médio de açúcar triplo de ferro (ETI) desidratado e dissolver em um litro de água destilada.

Aqueça até o ágar estar completamente dissolvido. Ferva por um minuto, mexendo sempre. Distribua 4 ml do meio nos tubos de ensaio 13/100 com tampa de algodão.

Esterilizar em autoclave a 121 ° C por 15 minutos. Retire da autoclave e deixe-a ficar inclinada. Deve-se tomar cuidado para que a base e o chanfro tenham a mesma distância.

Conservar no frigorífico 2-8 ° C. Deixe temperar antes de semear a cepa bacteriana.

A cor do meio desidratado é bege claro e o meio preparado é vermelho-laranja

O pH final do meio preparado é 7,3 ± 0,2.

Usos

O teste TSI é amplamente utilizado no laboratório de microbiologia. Este teste é essencial para orientar o tipo de teste que deve ser aplicado para identificar o gênero e a espécie.Sua boa execução e interpretação podem economizar material e mão de obra.

Se o resultado for uma ETI K / K e o teste do citocromo oxidase for positivo, sabe-se que testes para a identificação de bacilos Gram-negativos não fermentativos, como Pseudomonas, Alcalino, Achromobacter, Burkholderia, entre outros gêneros, devem ser utilizados. Se for oxidase negativa, está orientada para Acinetobacter, Stenotrophomonas, etc.

Por outro lado, se uma ETI A / A ou K / A for obtida e o teste do citocromo oxidase for negativo, reduzindo ainda mais os nitratos em nitritos, teremos certeza de que é um microorganismo pertencente à família Enterobacteriaceae. Nesse caso, a rota de identificação será direcionada para testes específicos para esse grupo de bactérias.

Por outro lado, se uma imagem K / A ou A / A for obtida e o teste do citocromo oxidase for positivo, os testes adicionais a serem montados serão direcionados à identificação de cepas de fermentação que não pertencem à família Enterobacteriaceae, como Aeromonas, Plesiomonas, Vibrio e Pasteurella.

Uma ETI com sulfeto de hidrogênio, oxidase negativa, orientará a identificação dos seguintes gêneros da família Enterobacteriaceae: Proteus, Citrobacter, Edwardsiella , Leminorella, Pragia, Trabusiella ou Salmonella.

Um sulfureto de ETI baixo ou moderado de hidrogénio no bisel inferior alcalino alcalino e um guia de teste positivo oxidase para utilizar para identificação de hastes gram-negativas fermentativa não produtoras de H 2 S, tais como a Shewanella putrefaciens .

Finalmente, a ETI pode ser usada para investigar a produção de sulfeto de hidrogênio em bacilos Gram-positivos, principalmente quando há suspeita de Erysipelothrix rhusiopathiae.

Semeado

O meio da ETI deve ser inoculado com colônias puras, isoladas em culturas primárias ou seletivas. Se a colônia for retirada de meios seletivos que foram semeados com amostras de flora mista, deve-se tomar cuidado apenas para retirar da superfície, pois na parte inferior da colônia pode haver cepas viáveis ​​inibidas nesse meio.

Portanto, você nunca deve esfriar a alça em um meio seletivo e, em seguida, pegue a colônia e inocule um meio TSI.

A semeadura será feita com uma agulha ou ansa reta. Uma punção será realizada, tomando cuidado para que ela atravesse o centro do meio até atingir o fundo e, em seguida, a semeadura termine inoculando a superfície em zigue-zague. Não faça duas perfurações.

Incubar a 37 ° C em aerobiose por 18-24 horas. Interprete neste momento, nem antes nem depois.

Limitações

O teste da ETI deve ser lido entre 18 a 24 horas de incubação. Uma leitura antes desse período pode dar um falso positivo da fermentação A / A. Embora uma leitura posterior nesse momento possa levar a uma imagem negativa falsa de não fermentador, devido ao consumo de peptonas que alcalinizam o meio.

Referências

  1. Mac Faddin J. (2003). Testes bioquímicos para a identificação de bactérias de importância clínica. 3rd ed. Editora Panamericana. Bons ares. Argentina
  2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnóstico microbiológico de Bailey & Scott. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
  3. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnóstico microbiológico 5a ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
  4. «Agar TSI.» Wikipedia, a enciclopédia livre . 10 de julho de 2018 às 08:09 UTC. 10 Feb 2019, 03:33 Disponível em: en.wikipedia.org
  5. Laboratórios britânicos. Agar ETI (Agar Triplo Ferro-Açúcar). 2015. Disponível em: britanialab.com
  6. Laboratórios BD Agar de açúcar e açúcar triplo (TSI Agar). 2003. Disponível em: bd.com

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