Coloração de esporos: fundamento, técnicas e usos

A coloração de esporos é a metodologia utilizada para colorir as estruturas de resistência que formam alguns géneros bacterianos quando em condições desfavoráveis; Essas estruturas correspondem a uma forma de sobrevivência.

Existem muitos gêneros que formam esporos; No entanto, os principais são Bacillus e Clostridium . Esses gêneros são considerados mais relevantes porque possuem espécies patogênicas para os seres humanos.

Coloração de esporos: fundamento, técnicas e usos 1

Coloração de esporos pelo método de Shaeffer – Fulton ou Wirtz-Conklin. E também (uploader original) [GFDL (http://www.gnu.org/copyleft/fdl.html) ou CC-BY-SA-3.0 (http://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0/ )], do Wikimedia Commons

Cada bacilo pode dar origem a um esporo. No momento da coloração da preparação, o esporo pode ser encontrado dentro do bacilo (endósporo) ou fora dele (exóspora). Com técnicas convencionais de coloração de bactérias – como a coloração de Gram -, os esporos ficam incolores.

Atualmente, existem várias metodologias de coloração que são capazes de passar através da estrutura espessa do esporo para tingir. Essas metodologias são muito variadas; Isso inclui a técnica de Dorner, a mancha de Möeller e a metodologia Shaeffer-Fulton, também conhecida como Wirtz-Conklin.

De todas as técnicas mencionadas, a metodologia Shaeffer-Fulton é a mais utilizada em laboratórios de rotina. Ele deve esse nome a dois microbiologistas que criaram a coloração em 1930: Alicia Shaeffer e MacDonald Fulton. No entanto, às vezes a técnica é chamada Wirtz-Conklin em homenagem a dois bacteriologistas dos anos 1900.

Fundação

Os esporos não mancham com cores convencionais porque possuem uma parede muito grossa. A composição complexa dos esporos impede a entrada da maioria dos corantes.

Se o esporo for estudado de fora para dentro, são observadas as seguintes camadas: em primeiro lugar, o exosporium, que é a camada mais fina e externa formada pelas glicoproteínas.

Depois vem a cutícula, que fornece resistência a altas temperaturas, seguida pela casca composta por peptidoglicano. Depois, há a parede da base que protege o protoplasto.

O esporo é uma estrutura desidratada que contém 15% de cálcio e ácido dipicolínico. Portanto, a maioria das técnicas de coloração de esporos se baseia na aplicação de calor para que o corante possa penetrar na estrutura espessa.

Uma vez que o esporo é tingido, ele não pode remover o corante. Na técnica Shaeffer – Fulton, o verde malaquita entra nas células vegetativas e, quando o calor é aplicado, penetra no endosporo e também nos exosporos.

Ao lavar com água, o corante é removido da célula vegetativa. Isso ocorre porque o corante verde malaquita é um pouco básico, por isso se liga fracamente à célula vegetativa.

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Por outro lado, não pode sair do esporo e, finalmente, o bacilo é contraído com safranina. Essa base é válida para o restante das técnicas, nas quais algo semelhante ocorre.

Técnicas de coloração de esporos

Para realizar a coloração de esporos, você deve ter uma cultura pura da cepa suspeita que deseja estudar.

A cultura é submetida a temperaturas extremas por 24 horas para estimular o microorganismo a esporular. Para isso, a cultura pode ser colocada em um forno a 44 ° C ou em uma geladeira (8 ° C) por 24 ou 48 horas.

Se as temperaturas mencionadas forem deixadas muito tempo, apenas exósporos serão observados, uma vez que todos os endósporos terão deixado o bacilo.

No final do tempo, algumas gotas de solução fisiológica estéril devem ser colocadas em uma lâmina limpa. Em seguida, uma pequena porção da colheita é tomada e uma propagação fina é realizada.

Em seguida, é permitido secar, fixado ao calor e corado com uma das técnicas explicadas abaixo:

Técnica de Dorner

1- Prepare em um tubo de ensaio uma suspensão concentrada do microrganismo esporulado em água destilada e adicione um volume igual de fucsina filtrada de Kinyoun filtrada.

2- Coloque o tubo em um banho com água fervente por 5 a 10 minutos.

3- Em uma lâmina limpa, misture uma gota da suspensão anterior com uma gota de solução aquosa de nigrosina a 10%, fervida e filtrada.

4- Espalhe e seque rapidamente com calor suave.

5- Examine com objetiva 100X (imersão).

Os esporos ficam vermelhos e as células bacterianas parecem quase incolores contra um fundo cinza escuro.

Técnica de Dorner modificada

1- Uma suspensão prolongada de microrganismos esporulados é feita sobre uma lâmina e fixada ao calor.

2- A amostra é coberta com uma tira de papel de filtro à qual é adicionada fucsina fenólica. O corante é aquecido por 5 a 7 minutos com a chama do queimador de Bunsen até que a liberação de vapores seja gerada. Em seguida, o papel é removido.

3- Lave a preparação com água e depois seque com papel absorvente.

4- O esfregaço é coberto com uma película fina de 10% de nigrosina, usando uma segunda lâmina para estender a nigrosina ou uma agulha.

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A cor obtida pelos esporos e bactérias é a mesma descrita na técnica anterior.

Shaeffer – técnica de Fulton ou Wirtz-Conklin

1- Faça uma pasta fina com uma suspensão do microrganismo esporulado em uma lâmina e deixe aquecer.

2- Cubra a lâmina com solução aquosa verde a malaquita a 5% (um papel de filtro pode ser colocado na folha).

3 – Aqueça a chama do queimador de Bunsen até que ele libere vapores e remova a chama. Repita a operação por 6 a 10 minutos. Se a solução verde malaquita evaporar demais durante o procedimento, mais pode ser adicionado.

4- Remova o papel de filtro (se colocado) e lave com água.

5- Cubra a lâmina com safranina aquosa a 0,5% por 30 segundos (algumas variantes da técnica usam safranina aquosa a 0,1% e deixe por 3 minutos).

Com esta técnica, os esporos aparecem verdes e os bacilos vermelhos.

Tem a desvantagem de que os endósporos das culturas jovens não mancham bem, pois parecem extremamente claros ou incolores. Para evitar isso, recomenda-se o uso de culturas de incubação de 48 horas.

Técnica de Möeller

1- Cubra o esfregaço com clorofórmio por 2 minutos.

2- Descarte o clorofórmio.

3- Cubra com 5% de ácido crômico por 5 minutos.

4- Lavar com água destilada

5- A folha é coberta com carbol de fucsina-fenólico e exposta à chama do queimador de Bunsen até a emissão de vapores; então ele se retira da chama por alguns momentos. A operação é repetida até 10 minutos.

6- Lave com água.

7- Use etanol acidificado (álcool clorídrico) para branquear. Deixe por 20 ou 30 segundos.

8- Lave com água destilada.

9- Contrato cobrindo a folha com azul de metileno por 5 minutos.

10- Lave com água destilada.

11- Deixe secar e leve a amostra ao microscópio.

Os esporos parecem bacilos vermelhos e azuis. É importante não aspirar os vapores, pois são tóxicos e podem ser cancerígenos a longo prazo.

Técnica de Möeller modificada sem calor

Em 2007, Hayama e seus colaboradores criaram uma modificação da técnica de Möeller. Eles eliminaram a etapa de aquecimento do corante e a substituíram pela adição de 2 gotas do surfactante Tergitol 7 para cada 10 ml de solução de carbol de fucsina-fenólica. Os mesmos resultados foram obtidos.

Usos

A coloração dos esporos fornece informações muito valiosas e úteis para a identificação do patógeno, uma vez que sua presença, forma, localização no bacilo e capacidade de deformar ou não a célula vegetativa são dados que podem orientar as espécies. envolvidos dentro de um determinado gênero.

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Nesse contexto, vale ressaltar que os esporos podem ser redondos ou ovais, localizados no centro ou também na posição paracentral, subterrânea ou terminal.

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Esquema da forma e posição dos endosporos e exosporos

Exemplos

– Clostridium difficile forma um esporo oval em uma posição terminal que deforma o bacilo.

– O esporo de Clostridium tertium é oval, não deforma o bacilo e está localizado no nível terminal.

– A endosfera do Clostridium tetani é terminal e deforma o bacilo, dando a aparência de uma baqueta.

– Os esporos de Clostridium botulinum , C. histolyticum , C. novy e C. septicum são subtermais redondos ou ovais e deformam o bacilo.

– O Clostridium sordelli endospora está localizado na posição central, com uma leve deformação.

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Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnóstico microbiológico (5ª ed.). Argentina, Editorial Panamericana SA

Referências

  1. Hayama M, Oana K, Kozakai T, Umeda S, Fujimoto J, Ota H, Kawakami Y. Proposta de uma técnica simplificada para a coloração de esporos bacterianos sem aplicar calor – modificação bem-sucedida do método de Moeller. Eur J Med Res. 2007; 16 12 (8): 356-9.
  2. Contribuidores da Wikipedia. Mancha Moeller. Wikipedia, A Enciclopédia Livre. 3 de novembro de 2018 às 03:28 UTC. Disponível em: en.wikipedia.org
  3. Pérez R, Juárez M, Rodríguez (2011). Manual de Laboratório de Técnicas Microbiológicas. Departamento de Ciências Básicas da Academia de Microbiologia. Instituto Politécnico Nacional.
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  5. Silva L, Silva C, Fernández N, Bueno C, Torres J, Rico M, Macías J et al. (2006). Funcionários da comunidade autônoma da Extremadura. Agenda específica Volume IV. Editorial MAD. Sevilha-Espanha, pp 211-212.
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  7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnóstico microbiológico (5ª ed.). Argentina, Editorial Panamericana SA
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