Endonucleases: funções, tipos e exemplos

As endonucleases são enzimas que cortam as ligações fosfodiéster localizados dentro da cadeia nucleotídica. Os locais de restrição das endonucleases são muito variados. Algumas dessas enzimas cortam o DNA (ácido desoxirribonucleico, nosso material genético) em quase qualquer lugar, ou seja, são inespecíficas.

Por outro lado, há outro grupo de endonucleases que são muito específicas na região ou sequência em que serão clivadas. Este grupo de enzimas é conhecido como enzimas de restrição e são muito úteis em biologia molecular. Neste grupo, temos as conhecidas enzimas Bam HI, Eco RI e Alu I.

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Endonucleases cortam DNA internamente.
Fonte: pixabay.com

Ao contrário das endonucleases, existem outros tipos de proteínas catalíticas – exonucleases – responsáveis ​​pela quebra das ligações fosfodiéster no final da cadeia.

Endonucleases de restrição

Endonucleases de restrição ou enzimas de restrição são proteínas catalíticas responsáveis ​​pela clivagem de ligações fosfodiéster dentro da cadeia de DNA em seqüências muito específicas.

Essas enzimas podem ser adquiridas em várias empresas de biotecnologia e seu uso é quase indispensável nas técnicas atuais de manipulação de DNA.

As endonucleases de restrição são nomeadas usando as primeiras letras do nome científico binomial do organismo de origem, seguidas pela cepa (isso é opcional) e terminam com o grupo de enzimas de restrição às quais pertencem. Por exemplo, Bam HI e Eco RI são endonucleases amplamente usadas.

A região do DNA que a enzima reconhece é chamada de local de restrição e é específica para cada endonuclease, embora várias enzimas possam coincidir nos locais de restrição. Este site geralmente consiste em uma sequência palindrômica curta de cerca de 4 a 6 pares de bases, como AGCT (para Alu I) e GAATTC para Eco RI.

Sequências palindrômicas são sequências que, embora lidas na direção 5 ‘a 3’ ou 3 ‘a 5’, são idênticas. Por exemplo, no caso de Eco RI, a sequência palindrômica é: GAATTC e CTTAAG.

Funções e aplicações de endonucles de restrição

Felizmente para os biólogos moleculares, as bactérias desenvolveram no curso da evolução uma série de endonucleases de restrição que fragmentam internamente o material genético.

Na natureza, essas enzimas evoluíram – presumivelmente – como um sistema de proteção bacteriana contra a invasão de moléculas de DNA estranhas, como as de fagos.

A fim de discriminar entre o seu próprio material genético e o estrangeiro, essas endonucleases de restrição podem reconhecer sequências nucleotídicas específicas. Assim, o DNA que não possui essa sequência pode ser imperturbável dentro da bactéria.

Por outro lado, quando a endonuclease reconhece o local de restrição, ela se liga ao DNA e o corta.

Os biólogos estão interessados ​​em estudar o material genético dos seres vivos . No entanto, o DNA é composto de vários milhões de pares de bases. Essas moléculas são extremamente longas e devem ser analisadas em pequenos fragmentos.

Para atingir esse objetivo, as endonucleases de restrição são integradas nos vários protocolos de biologia molecular. Por exemplo, um gene individual pode ser capturado e replicado para análises futuras. Esse processo é chamado de “clonagem” de um gene.

Polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP)

Os polimorfismos de comprimento de fragmento de restrição referem-se ao padrão de sequências nucleotídicas específicas no DNA que as endonucleases de restrição são capazes de reconhecer e cortar.

Graças à especificidade das enzimas, cada organismo é caracterizado por um padrão específico de corte no DNA, originando fragmentos de comprimentos variáveis.

Tipos de endonucleases de restrição

Historicamente, as endonucleases de restrição foram classificadas em três tipos de enzimas, designadas por números romanos. Ultimamente, um quarto tipo de endonuclease foi descrito.

Tipo I

A característica mais importante das endonucleases do tipo I é que elas são proteínas formadas por várias subunidades. Cada uma dessas funções funciona como um único complexo proteico e geralmente possui duas subunidades chamadas R, duas M e uma S.

A porção S é responsável pelo reconhecimento do local de restrição no DNA. A subunidade R, enquanto isso, é essencial para a clivagem e M é responsável por catalisar a reação de metilação.

Existem quatro subcategorias de enzimas do tipo I, conhecidas pelas letras A, B, C e D, que são comumente usadas. Essa classificação é baseada na complementação genética.

As enzimas do tipo I foram as primeiras endonucleases de restrição a serem descobertas e purificadas. No entanto, os mais úteis em biologia molecular são aqueles do tipo II que serão descritos na próxima seção.

Tipo II

As endonucleases de restrição tipo II reconhecem sequências específicas de DNA e executam a clivagem em uma posição constante próxima a uma sequência que produz fosfatos 5 ‘e hidroxilos 3’. Eles geralmente requerem íons de magnésio (Mg 2+ ) como cofatores , mas existem alguns que têm muitos requisitos mais específicos.

Estruturalmente, eles podem aparecer como monômeros, dímeros ou mesmo tetrâmeros. A tecnologia recombinante utiliza endonucleases do tipo II e, por esse motivo, mais de 3.500 enzimas foram caracterizadas.

Tipo III

Esses sistemas enzimáticos são compostos de dois genes, chamados mod e res, que codificam subunidades que reconhecem o DNA e modificações ou restrições. Ambas as subunidades são necessárias para restrição, um processo totalmente dependente da hidrólise do ATP .

Para clivar a molécula de DNA, a enzima deve interagir com duas cópias da sequência de reconhecimento não palindrômico e os locais devem estar em uma orientação inversa no substrato. A clivagem é precedida por uma translocação do DNA.

Tipo IV

Um grupo adicional foi identificado recentemente. O sistema é composto por dois ou mais genes que codificam proteínas que clivam apenas seqüências de DNA modificadas, glucosil metilada, hidroximetilada ou hidrometilada.

Por exemplo, a enzima EckKMcrBC reconhece dois dinucleotídeos da forma geral de RmC; uma purina seguida de uma citosina metilada, que pode ser separada por vários pares de bases – de 40 a quase 3000. A clivagem ocorre cerca de 30 pares de bases atrás do local que a enzima reconhece.

Endonucleases do tipo V

Endonucleases desse tipo também são conhecidas como endonucleases ” homing “. Estas enzimas reconhecem e cortam a sequência de DNA alvo em locais únicos do genoma de 14 a 40 pb.

Essas enzimas são frequentemente codificadas em íntrons e acredita-se que sua função seja promover a transferência horizontal das seqüências de corte. Após o corte, ocorre um reparo de ruptura na dupla hélice de DNA, com base na sequência complementar.

Exemplos

A endonuclease E. coli atua como um sistema de defesa contra fagos e parasitas. Está localizado principalmente entre a membrana citoplasmática e a parede celular. Produz quebras de fita dupla no DNA estranho com o qual interage no espaço periplásmico.

As endonucleases do tipo CRISPR-Cas são enzimas que atuam no mecanismo de defesa de muitos tipos de bactérias. Eles identificam e cortam sequências específicas de DNA de organismos invasores, que geralmente são vírus.

Recentemente, pesquisadores do Instituto de Tecnologia de Massachusetts (MIT) descobriram o sistema de edição genômica CRISPR-Cas12bm com alta precisão para a modificação de células humanas.

Referências

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