DNA recombinante: técnica, aplicações e fundamentos

O ADN recombinante (ADNr ou rADN) é uma molécula de ácido nucleico artificial criado no laboratório, através da integração de dois segmentos de organizações de interesse. Também é conhecido como DNA quimérico, graças à sua propriedade híbrida. Este tipo de DNA não é encontrado na natureza.

A metodologia básica para gerá-lo inclui: (a) a seleção de um DNA branco e sua inserção em outro fragmento de DNA (geralmente um plasmídeo bacteriano); (b) a introdução deste plasmídeo em uma bactéria; (c) a seleção da bactéria por meio de antibióticos e finalmente (d) a expressão do gene.

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Fonte: pixabay.com

A técnica tira proveito de um conjunto de enzimas que permitem copiar e colar fragmentos específicos de DNA, a critério do investigador.

O objetivo da tecnologia recombinante é, na maioria dos casos, a expressão de uma proteína (conhecida como proteína recombinante) desejada pelo biólogo molecular para pesquisas futuras ou para criar uma proteína de valor comercial e terapêutico – como a insulina humana, por exemplo.

Fundamentos da técnica de DNA recombinante e seu uso em engenharia genética

O dogma central da biologia molecular

Todos os seres orgânicos que conhecemos compartilham várias características. Uma delas é a natureza do material genético e a maneira como as proteínas são produzidas – um processo conhecido como o “dogma” central da biologia molecular.

Com exceção de um par de vírus, todos os organismos armazenam as informações genéticas no DNA (ácido desoxirribonucleico), coletadas de maneira muito compacta e organizada no núcleo celular.

Para a expressão dos genes, a molécula de DNA é transcrita para o RNA mensageiro, e o último é traduzido para a linguagem dos aminoácidos, os blocos estruturais das proteínas.

O que é um DNA recombinante?

Entre os anos 70 e 80, os biólogos moleculares começaram a tirar proveito dos processos que ocorrem naturalmente dentro da célula e conseguiram extrapolá-los para o laboratório.

Dessa maneira, um gene de origem animal (um vertebrado, por exemplo) pode ser inserido em um segmento de DNA de uma bactéria; ou o DNA de uma bactéria pode ser combinado com um DNA viral. Assim, podemos definir um DNA recombinante como uma molécula composta por DNA de dois organismos diferentes.

Uma vez criada esta molécula híbrida ou recombinante, o gene de interesse é expresso. Com a palavra expressão , queremos nos referir ao processo de tradução de proteínas.

Enzimas de restrição e ligases: a chave do processo

Um elemento chave no desenvolvimento da tecnologia de DNA recombinante foi a descoberta de enzimas de restrição.

Essas são moléculas de proteína que exibem a capacidade de clivar o DNA (nucleases) em sequências específicas, servindo como “tesouras moleculares”. Os fragmentos gerados por essas enzimas são chamados fragmentos de restrição.

As referidas enzimas podem produzir cortes simétricos (em ambas as cadeias na mesma altura) ou cortes assimétricos na sequência branca. Um aspecto chave da ação das enzimas de restrição é que, após a clivagem das cadeias, é obtida uma “borda solta”, complementar à outra borda cortada pela mesma enzima.

Alguns exemplos são ECOR 1 e Sma 1. Atualmente, mais de 200 tipos de enzimas de restrição são conhecidos e estão disponíveis comercialmente.

Para ser útil, uma tesoura deve ser acompanhada de cola. Esta ação de selagem de DNA (previamente tratada com enzimas de restrição) é realizada por ligases.

Técnica: Como o DNA de um organismo no laboratório é artificialmente modificado?

Vamos agora descrever as principais etapas exigidas pela tecnologia de DNA recombinante. Todos são realizados por profissionais de um laboratório de biologia molecular.

O que é um “clone”?

Antes de continuar com o protocolo experimental, devemos observar que na biologia molecular e na biotecnologia o termo “clone” e o verbo “clone” são amplamente utilizados. Isso pode causar confusão.

Nesse contexto, não estamos nos referindo à clonagem de um organismo inteiro (como no caso das famosas ovelhas Dolly, por exemplo), mas à clonagem de um fragmento de DNA, que pode ser um gene. Ou seja, produza muitas cópias – geneticamente idênticas – da sequência.

1. Isolamento e obtenção de DNA

O primeiro passo é decidir qual sequência você deseja usar. Isso depende inteiramente do pesquisador e dos objetivos de seu trabalho. Então, esse DNA deve ser isolado e purificado. Os métodos e procedimentos para alcançar isso dependem do organismo e do tecido.

Um pedaço de tecido é geralmente retirado e tratado em um tampão de lise com proteinase K (uma enzima proteolítica) e, em seguida, o DNA é extraído. Posteriormente, o material genético é fragmentado em pequenos fragmentos.

2. Vetor de clonagem

Após as etapas preparatórias, o pesquisador procura introduzir o segmento de DNA de interesse em um vetor de clonagem. A partir de agora, chamaremos esse segmento de DNA de DNA branco.

Plasmídeos

Um dos vetores mais utilizados em um plasmídeo de origem bacteriana. Um plasmídeo é uma molécula de DNA circular de fita dupla que encontramos naturalmente nas bactérias. São entidades estranhas ao cromossomo bacteriano – isto é, são extracromossômicas e são encontradas naturalmente nesses procariontes.

Os elementos básicos de um vetor são: (a) uma origem de replicação, que permite a síntese de DNA; (b) agente de seleção, que permite a identificação de organismos que transportam o plasmídeo com DNA branco, como resistência a um antibiótico; e (c) local de multiclonagem, onde são encontradas as seqüências que serão reconhecidas pelas enzimas de restrição.

O primeiro DNA recombinante de sucesso no laboratório foi clonado no plasmídeo pSC101 a partir da bactéria E. coli. Ele contém um local de restrição para a enzima de restrição EcoRI e um gene de resistência a antibióticos, além da origem da replicação.

A inserção do DNA branco no plasmídeo é feita usando as ferramentas moleculares das enzimas de restrição e ligases descritas na seção anterior.

Tipos de vetores restantes

Além dos plasmídeos, o DNA pode ser inserido em outro vetor, como o bacteriófago lambda, cosmídeos, YAC (cromossomos de levedura artificiais), BAC (cromossomo artificial de bactérias) e fagóides.

3. Introdução de DNA recombinante

Uma vez obtida a molécula de DNA recombinante (gene de interesse no plasmídeo ou outro vetor), ela é introduzida em um hospedeiro ou organismo hospedeiro, que pode ser uma bactéria.

Para introduzir DNA estranho em uma bactéria, é usada uma técnica chamada transformação bacteriana, em que o corpo é submetido a um tratamento com cátions divalentes que o torna suscetível ao DNA.

Metodologicamente, não podemos garantir que 100% das bactérias em nossa cultura tenham efetivamente capturado nossa molécula de DNA recombinante. É aqui que a porção do plasmídeo que contém a resistência aos antibióticos entra em cena.

Assim, as bactérias que tomaram o plasmídeo serão resistentes a um determinado antibiótico. Para selecioná-los, basta aplicar o referido antibiótico e levar os sobreviventes.

4. “Colha” a proteína

Após selecionar as bactérias com nosso DNA recombinante, passamos a usar o mecanismo enzimático do hospedeiro para gerar o produto proteico de interesse. À medida que a bactéria se reproduz, o plasmídeo passa para a prole, para que não seja perdido durante a divisão.

Este procedimento usa as bactérias como uma espécie de proteína “de fábrica”. Mais tarde, veremos que esse foi um procedimento muito relevante no desenvolvimento de tratamentos médicos eficazes.

Quando a cultura está pronta e as bactérias produzem grandes quantidades de proteínas, é realizada a lise ou a degradação celular. Existe uma ampla gama de técnicas bioquímicas que permitem a purificação de proteínas de acordo com suas características físico-químicas.

Em outro contexto experimental, podemos não estar interessados ​​em gerar a proteína, mas estamos interessados ​​em obter a sequência de DNA per se . Se fosse esse o caso, o plasmídeo serviria para criar várias cópias do fragmento que nos interessa, a fim de ter DNA branco suficiente para realizar as experiências relevantes.

Aplicações

A tecnologia de DNA recombinante abriu um número infinito de possibilidades para a biologia molecular, biotecnologia, medicina e outras áreas relacionadas. Suas aplicações mais importantes são as seguintes.

Análise genética

A primeira aplicação está diretamente relacionada aos laboratórios de biologia molecular. A tecnologia de DNA recombinante permite que os pesquisadores entendam a função normal dos genes, e as proteínas geradas podem ser usadas em investigações subsequentes.

Indústria farmacêutica

As proteínas produzidas pelo procedimento de DNA recombinante têm aplicações na medicina. Dois exemplos muito relevantes no campo são a insulina humana e o hormônio do crescimento, que é aplicado em pacientes sem essa proteína.

Graças ao DNA recombinante, essas proteínas podem ser geradas sem a necessidade de extraí-las de outro ser humano, o que representa complicações metodológicas adicionais e riscos à saúde. Isso ajudou a melhorar a qualidade de vida de inúmeros pacientes.

Referências

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